本发明属于生物工程发酵技术领域，尤其涉及一种利用酱油渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术：
γ-聚谷氨酸，分子量在10-1000kda，在众多领域里都有应用，在食品方面可用于抗冻剂、增稠剂、除涩剂等，在化妆品业中可用于保湿面膜等，在医药行业中，可用作为药物载体、粘合剂等，在农业中，对土壤植物有较好的保水性，也可作为肥料增效剂等，在工业上可用于高分子生物絮凝剂、重金属吸附剂等，由此可以看出，γ-聚谷氨酸在许多领域都具有良好的应用前景。目前研究的γ-聚谷氨酸的生产方法多为液体发酵，液体发酵法成本高，发酵过程受溶解氧和底物浓度的限制，传氧传质效率低，因此固态发酵法具有很高的应用前景。
固态发酵时需要制备固态发酵基料，一般固态发酵基料使用豆粕、麸皮、秸秆、谷类等，尚未发现采用传统的方式以酱油渣为基质混合麸皮、谷糠等农废物为辅料固态发酵生产γ—聚谷氨酸方法。
酱油渣是制作酱油后的残渣，主要是制作酱油的原料大豆豆饼或豆粕、蚕豆、豌豆、小麦和食盐等经发酵后产生固形物质。由于未经过干燥的酱油渣水分含量高且含有丰富的蛋白质和碳水化合物，微生物易生长繁殖，极易腐败变质，产生恶臭气味，若不进行及时处理会造成环境污染。目前，由于没有成熟的酱油渣再利用技术，低盐固态酱油渣常作为肥料或饲料低价出售，而高盐稀态工艺产生的压榨酱油渣往往因为含盐量过高，不能直接作为饲料用于动物，部分厂家采用直接填埋的方式处理，但会导致填埋土壤盐化。作为酱油渣产量最大的我国，除了有用作饲料、肥料的研究报道外，其他方面的研究进行的极少，为了减少它对生态环境以及动物造成的危害，使其资源科循环利用，我国应对酱油渣的研究引起足够重视。因此，研究酱油渣的可利用性就显得尤为重要。
中国专利cn109182405a涉及一种利用地衣芽抱杆菌固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，该发明利用豆粕和天然矿物做作为固态发酵基料，混入一定比例的营养液，接种地衣芽抱杆菌，通过固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，促进了豆粕的综合开发、高值化利用并降低了生产成本。
中国专利cn105316370a提供一种利用纳豆芽孢杆菌固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，该发明的方法包括：配制豆粕固态发酵基料，混入营养补充剂，制成固态发酵培养基，接种纳豆芽孢杆菌，恒温保湿4-10天，用水搅拌提取γ-聚谷氨酸，过滤，滤液旋蒸浓缩后加入乙醇，沉淀γ-聚谷氨酸，离心回收得到γ-聚谷氨酸。
以上两篇专利均利用豆粕作为固态发酵基料，而豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，作为一种高蛋白质，豆粕是制作牲畜与家禽饲料的主要原料，还可以用于制作糕点食品，健康食品以及化妆品和抗菌素原料，易吸收利用、防病、能提高饲料利用率。虽然研究出了豆粕作为固态发酵基料能产生γ-聚谷氨酸，但豆粕并不像酱油渣那样会对生态环境以及动物造成危害，因而不存在迫切处理的问题，这两篇发明只是提供了利用豆粕生产γ-聚谷氨酸的方法，并不像本发明这样，针对酱油渣污染环境的问题作出了研究，并能将酱油渣作为固态发酵基材生产γ-聚谷氨酸，所以本发明的研究对环境保护有着重要的意义。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种利用酱油渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，使用酱油渣及麸皮、谷糠等农废物辅料作为固态发酵基材生产γ-聚谷氨酸，不仅能制得γ-聚谷氨酸，还能解决酱油渣处理不及时或处理不当造成的环境污染问题，将酱油渣变废为宝。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用酱油渣固态发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：酱油渣固态发酵培养基的配制及地衣芽孢杆菌菌种的活化培养；
步骤2：接种及固态发酵过程：在步骤1配制好的酱油渣固态发酵培养基中接种地衣芽孢杆菌，进行固态发酵，产生γ-聚谷氨酸；
步骤3：γ-聚谷氨酸的提取：将步骤2含有γ-聚谷氨酸的培养基进行分离提纯得到精制γ-聚谷氨酸。
所述步骤1中，酱油渣固态发酵培养基的配制过程包括：原材料的预处理，酱油渣固态发酵基料的配制，酱油渣固态发酵培养基的制备。
所述原材料的预处理包括：酱油渣的脱盐处理；酱油渣的烘干；酱油渣的粉碎及辅料的粉碎。
所述酱油渣的脱盐处理过程为：以酱油渣和水的质量比1：2混合均匀，充分搅拌，用4层纱布过滤，将得到的滤渣，平铺于浅盘中；
优选地，所述酱油渣的烘干过程为：将上述脱盐后的酱油渣置于60℃的鼓风干燥箱内，烘干24h；
优选地，所述酱油渣的粉碎及辅料的粉碎过程为：将脱盐烘干的酱油渣和辅料放入粉碎机中分别粉碎，过20目筛备用。
所述酱油渣固态发酵基料的配制过程为：将粉碎后的酱油渣和辅料按重量比为1：1混合均匀。
所述酱油渣固态发酵培养基的制备过程为：在酱油渣固态发酵基料中补入营养补充剂，两者的重量比为1:0.5-1。
所述的营养补充剂包括：葡萄糖、谷氨酸钠、k2so4、(nh4)2so4和水，葡萄糖、谷氨酸钠、k2so4、(nh4)2so4的重量千分浓度依次分别为：60-80‰、20-60‰、10-20‰、5-10‰，其余为水，ph为7.0-7.2。
所述步骤1中地衣芽孢杆菌菌种的活化培养过程为：将地衣芽孢杆菌菌种在一级斜面上于37℃培养24h，接种到种子培养基中，37℃摇瓶培养12-18小时至生长对数期作为固体发酵菌种备用；
优选地，所述一级斜面为lb斜面，所述lb斜面的培养基成分为蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％，自然ph。
所述步骤2中的接种及固态发酵过程为：将地衣芽孢杆菌按体积重量比5-10％(v/w)接种于酱油渣固态发酵培养基中，充分搅拌，使菌种均匀分布于培养基表面，接种后的培养箱保持35-37℃恒温，培养箱内湿度严格保持在50％以上，发酵3-5天。
所述步骤3中γ-聚谷氨酸的提取过程为：在固态发酵物中加水搅拌，离心并收集清液旋蒸浓缩，再在浓缩后的清夜中加入乙醇静置沉淀，离心后在得到的沉淀物中加乙醇洗涤，真空冷冻干燥，得到精制的γ-聚谷氨酸；
优选地，所述步骤3中γ-聚谷氨酸的提取过程为：加入固态发酵物5倍体积的水搅拌提取1-2小时，经过5000r/min离心后，收集清液，将清液旋蒸浓缩至50ml，再加入4倍体积的乙醇，静置6-24小时，离心收集沉淀，然后用2倍体积的乙醇洗涤，液氮处理研磨，真空冷冻干燥，得到精制的γ-聚谷氨酸。
本发明的有益效果是：
1、以酱油渣为发酵基料，以农废物麸皮、谷糠等为辅料，加入—定比例的营养液，固态发酵γ-聚谷氨酸，提供了—种高效大量生产γ-聚谷氨酸的方法，解决了酱油厂酱油压榨后残余物难以处理的问题，避免了酱油渣处理不当造成的环境污染，同时促进了酱油渣的综合开发、高值化利用，并降低了生产成本。
2、采用固态发酵的方法能更好的提高发酵过程中传氧效果，静置发酵减少了剪切力对聚谷氨酸分子量降低的不利因素，生产成本更低，较液态发酵相比提高了γ-聚谷氨酸的产量，是一种经济绿色可持续的技术方法。
3、采用传统的固态发酵方式静置发酵，节约了大量能源，具有天然无污染的效果，发酵后的固体残渣，经过合理调配，可直接应用于农田生产，不仅不会污染环境，还对土壤有着保湿增效的效果，将酱油渣变废为宝，并为酱油渣的处理提供了一种新的研究方向，给酱油渣的应用奠定了良好的基础。
4、生产得到的γ-聚谷氨酸在众多领域里都有应用，在食品方面可用于抗冻剂、增稠剂、除涩剂等，在化妆品业中可用于保湿面膜等，在医药行业中可用作为药物载体、粘合剂等，在农业中对土壤植物有较好的保水性，也可作为肥料增效剂等，在工业上可用于高分子生物絮凝剂、重金属吸附剂等，因此，γ-聚谷氨酸在许多领域都具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步解释说明。
实例1：
地衣芽孢杆菌的活化培养。该技术为现有技术，具体过程为：一级斜面采用lb斜面，将保藏的菌种在lb斜面上于37℃培养24h，接种到种子培养基中，37℃摇瓶培养12-18小时至生长对数期作为固体发酵菌种备用。其中保藏的菌种由天津北洋百川生物技术有限公司提供。lb培养基的成分为蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％，自然ph。
将20g酱油渣和20g麸皮作为固体发酵基料；将葡萄糖2.4g、谷氨酸钠2.4g、k2so40.4g、(nh4)2so40.2g，用40ml水充分溶解，用hcl或naoh水溶液调ph值为7.2，作为营养补充剂待用；将酱油渣粉碎后过20目筛和麸皮混匀作为固体发酵基料；将上述固体发酵基料混入营养补充剂，两者按照1:1的重量比例混合均匀成固体发酵培养基，置于摇瓶中，121℃20min蒸汽灭菌，冷却至常温后，按照10％v/w的比例接种在上述的固体发酵培养基中，搅拌均匀后，于37℃培养箱内固体发酵3天，环境湿度在50％以上，每天翻拌，使培养物混合均匀。
发酵3天后，用200ml蒸馏水浸渍摇瓶中发酵物，在恒温摇床中持续1h，恒温摇床的转速为150r/h，取出50ml浸出液，在离心机中以5000r/min的速度离心10min，收集清液，清液进行旋转蒸发浓缩至50ml，向液体中加入200ml乙醇，充分搅拌，在离心机中以15000转/分钟的速度离心10分钟，得到的沉淀为γ-聚谷氨酸的粗制品。
将得到的γ-聚谷氨酸的粗制品用2倍体积的乙醇洗涤沉淀，抽滤回收，液氮处理研磨，真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸精制品，每公斤原料干物质的γ-聚谷氨酸得率为24.12g。
实例2：
地衣芽孢杆菌的活化和培养。一级斜面采用lb斜面，于37℃培养24h，接种到种子培养基中，37℃摇瓶培养12-18小时至生长对数期作为固体发酵菌种备用。其中保藏的菌种由天津北洋百川生物技术有限公司提供。lb培养基的成分为蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％，自然ph。
将20g酱油渣和20g麸皮作为固体发酵基料；将葡萄糖3.2g、谷氨酸钠2.4g、k2so40.8g、(nh4)2so40.4g，用40ml水充分溶解，用hcl或naoh水溶液调ph值为7.0，作为营养补充剂待用；将酱油渣粉碎后过筛和麸皮混匀作为固体发酵基料；将上述固体发酵基料混入营养补充剂，两者按照1:1的重量比例混合均匀成固体发酵培养基,置于摇瓶中，121℃20min蒸汽灭菌，冷却至常温后，按照10％v/w的比例接种在上述的固体发酵培养基中，搅拌均匀后，于37℃培养箱内固体发酵5天，环境湿度在50％以上，每天翻拌，使培养物混合均匀。
发酵5天后，用200ml蒸馏水浸渍摇瓶中发酵物，在恒温摇床中持续1h，恒温摇床的转速为150r/h，取出50ml浸出液，在离心机中以5000r/min的速度离心10min，收集清液，清液进行旋转蒸发浓缩至50ml，向清液中加入200ml乙醇，充分搅拌，在离心机内以15000转/分钟的速度离心10分钟，得到的沉淀为γ-聚谷氨酸的粗制品。
将得到的γ-聚谷氨酸的粗制品用2倍体积的乙醇洗涤沉淀，抽滤回收，液氮处理研磨，真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸精制品，每公斤原料干物质的γ-聚谷氨酸得率为52.14g。
实例3：
地衣芽孢杆菌的活化和培养。一级斜面采用lb斜面，于37℃培养24h，接种到种子培养基中，37℃摇瓶培养12-18小时至生长对数期作为固体发酵菌种备用。其中保藏的菌种由天津北洋百川生物技术有限公司提供。lb培养基的成分为蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％，自然ph。
将20g酱油渣和20g麸皮作为固体发酵基料；将葡萄糖3.2g、谷氨酸钠2g、k2so40.4g、(nh4)2so40.4g，用40ml水充分溶解，用hcl或naoh水溶液调ph值为7.0，作为营养补充剂待用；将酱油渣粉碎后过20目筛和麸皮混匀作为固体发酵基料；将上述固体发酵基料混入营养补充剂，两者按照1:1的重量比例混合均匀成固体发酵培养基，置于摇瓶中，121℃20min蒸汽灭菌，冷却至常温后，按照8％v/w的比例接种在上述的固体发酵培养基中，搅拌均匀后，于35℃培养箱内固体发酵5天，环境湿度在50％以上，每天翻拌，使培养物混合均匀。
发酵5天后，用200ml蒸馏水浸渍摇瓶中发酵物，在恒温摇床中持续1h，恒温摇床的转速为150r/h，取出50ml浸出液，在离心机上以5000r/min的速度离心10min，收集清液，清液进行旋转蒸发浓缩至50ml，向液体中加入200ml乙醇，充分搅拌，15000转/分钟离心10分钟，得到的沉淀为γ-聚谷氨酸的粗制品。
将得到的γ-聚谷氨酸的粗制品用2倍体积的乙醇洗涤沉淀，抽滤回收，液氮处理研磨，真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸精制品，每公斤原料干物质的γ-聚谷氨酸得率为21.26g。
实例4：
地衣芽孢杆菌的活化和培养。一级斜面采用lb斜面，于37℃培养24h，接种到种子培养基中，37℃摇瓶培养12-18小时至生长对数期作为固体发酵菌种备用。其中保藏的菌种由天津北洋百川生物技术有限公司提供。lb培养基的成分为蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％，自然ph。
将20g酱油渣和20g麸皮作为固体发酵基料；将葡萄糖1.2g、谷氨酸钠1g、k2so40.2g、(nh4)2so40.2g，用20ml水充分溶解，用hcl或naoh水溶液调ph值为7.1作为营养补充剂待用；将酱油渣粉碎后过20目筛和麸皮混匀作为固体发酵基料；将上述固体发酵基料混入营养补充剂，两者按照1:1的重量比例混合均匀成固体发酵培养基，置于摇瓶中，121℃20min蒸汽灭菌，冷却至常温后，按照10％v/w的比例接种在上述的固体发酵培养基中，搅拌均匀后，于35℃培养箱内固体发酵4天，环境湿度在50％以上，每天翻拌，使培养物混合均匀。
发酵4天后，用200ml蒸馏水浸渍摇瓶中发酵物，在恒温摇床中持续1h，恒温摇床的转速为150r/h，取出50ml浸出液，在离心机中以5000r/min的速度离心10min，收集清液，清液进行旋转蒸发浓缩至50ml，向液体中加入200ml乙醇，充分搅拌，在离心机中以15000转/分钟的速度离心10分钟，得到的沉淀为γ-聚谷氨酸的粗制品。
将得到的γ-聚谷氨酸的粗制品用2倍体积的乙醇洗涤沉淀，抽滤回收，液氮处理研磨，真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸精制品，每公斤原料干物质的γ-聚谷氨酸得率为20.10g。
实例5：
地衣芽孢杆菌的活化和培养。一级斜面采用lb斜面，于37℃培养24h，接种到种子培养基中，37℃摇瓶培养12-18小时至生长对数期作为固体发酵菌种备用。其中保藏的菌种由天津北洋百川生物技术有限公司提供。lb培养基的成分为蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，氯化钠1％，自然ph。
将20g酱油渣和20g麸皮作为固体发酵基料；将葡萄糖3g、谷氨酸钠1.6g、k2so40.4g、(nh4)2so40.4g，用40ml水充分溶解，用hcl或naoh水溶液调ph值为7.0，作为营养补充剂待用；将酱油渣粉碎后过20目筛和麸皮混匀作为固体发酵基料；将上述固体发酵基料混入营养补充剂，两者按照1:1的重量比例混合均匀成固体发酵培养基，置于摇瓶中，121℃20min蒸汽灭菌，冷却至常温后，按照5％v/w的比例接种在上述的固体发酵培养基中，搅拌均匀后，于37℃培养箱内固体发酵5天，环境湿度在50％以上，每天翻拌，使培养物混合均匀。
发酵5天后，用200ml蒸馏水浸渍摇瓶中发酵物，在恒温摇床中持续1h，恒温摇床的转速为150r/h，取出50ml浸出液，在离心机中以5000r/min的速度离心10min，收集清液，清液进行旋转蒸发浓缩至50ml，向液体中加入200ml乙醇，充分搅拌，在离心机中以15000转/分钟速度离心10分钟，得到的沉淀为γ-聚谷氨酸的粗制品。
将得到的γ-聚谷氨酸的粗制品用2倍体积的乙醇洗涤沉淀，抽滤回收，液氮处理研磨，真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸精制品，每公斤原料干物质的γ-聚谷氨酸得率为33.48g。
以上对本发明的几个实例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。