本发明所属生物医药技术领域，涉及一种3-苯基马来酸异构酶nshphcd及其在生物合成l-高苯丙氨酸中的应用。
背景技术：
由3-苯基马来酸异构酶催化的羟基异构化反应将2-羟基移位至3-羟基，是生物合成l-高苯丙氨酸过程中的限速步骤。l-高苯丙氨酸是一种重要的药物中间体，用于合成血管紧张素转换酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂类药物，如依那普利，赖诺普利，奎那普利，卡非佐米等，具有良好的应用前景。
nshphcd来源于蓝细菌nodulariaspumigenauhcc0039，可催化l-高苯丙氨酸合成中间体2-苯基马来酸(2-bma)的羟基异构化反应生成3-苯基马来酸(3-bma)，尚未有利用nshphcd生物合成l-高苯丙氨酸的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种3-苯基马来酸异构酶nshphcd。
本发明的第二个目的是提供3-苯基马来酸异构酶nshphcd在生物合成l-高苯丙氨酸中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
3-苯基马来酸异构酶nshphcd，其氨基酸序列用seqidno.1所示。
3-苯基马来酸异构酶nshphcd在生物合成l-高苯丙氨酸中的应用。
本发明的优点：
本发明提供一种3-苯基马来酸异构酶基因，并成功构建了由该基因和苯基马来酸合成酶基因以及3-苯基马来酸脱氢酶基因组成的重组表达载体，建立生物合成方法以l-苯丙氨酸为底物直接合成了l-高苯丙氨酸。本发明3-苯基马来酸异构酶催化活性高，可解决l-高苯丙氨酸合成过程中的中间体积累问题，有利于工业化生产。
具体实施方式
本发明所用大肠杆菌菌株e.colibl21(de3)和e.colidh5α购买自北京全式金生物技术有限公司。
lb培养基组成为：10g/lnacl、10g/l蛋白胨和5g/l酵母粉，余量为水，0.1mpa压力121℃下灭菌20min。
含有葡萄糖的发酵培养基组成为：16g/lkh2po4、14g/lk2hpo4、2g/l(nh4)2so4、1g/l柠檬酸、5g/l酸水解酪蛋白、10mg/lmnso4·5h2o，余量为水，培养基在0.1mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入终浓度为2g/lmgso4、50mg/lfeso4·7h2o、10mg/l硫胺素和10g/l葡萄糖。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例13-苯基马来酸异构酶基因nshphcd的获得
根据3-苯基马来酸异构酶nshphcd的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，同时去除常用酶切位点，设计全长nshphcd基因，所述核酸序列如seqidno.02示。同时设计全长nphpha基因和nshphb基因。设计将nphpha基因和nshphcd基因连接在第一个trc启动子下游，将nshphb基因连接在第二个trc启动子下游，全人工合成两端分别加上xbai和ndei酶切位点的ptrc-nphpha-nshphcd-ptrc-nshphb基因片段，得到的基因片段命名为facdb。
将通过化学全合成得到的facdb片段，通过pcr方法扩增。用高保真dna聚合酶，建立pcr体系。以facdb-f(seqidno.3)和facdb-r(seqidno.4)为引物，facdb片段为模板大量扩增制备。
pcr过程是，95℃变性5min；95℃变性30s，选择55℃退火30s，延伸时间为45s，循环数为30个。扩增facdb片段，纯化扩增产物后，备用。
实施例2重组表达载体pef的构建
将facdb片段使用fastdigest内切酶xbai和ndei进行酶切，反应体系为：5μl10*fdbuffer、2.5μlxbai内切酶、2.5μlndei内切酶、30μlfacdb片段和10μl超纯水。反应条件为：37℃，2h。并用试剂盒纯化回收得到用xbai和ndei双酶切的facdb片段。将用xbai和ndei双酶切的facdb片段与相同酶切线性化的表达载体骨架petduet-1的复制子和抗性片段进行连接反应得到pef质粒。其连接反应体系为：1μl10*t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、6μl用xbai和ndei双酶切的facdb片段和2μl相同酶切后的表达载体骨架。连接反应条件为：30℃，0.5h。
实施例3重组大肠杆菌的构建及生物合成l-高苯丙氨酸
1.重组大肠杆菌的构建
将所构建的载体pef电击转化进入宿主细胞e.colibl21(de3)中，得到重组菌株bzl01。
2.重组菌bzl01生物合成l-高苯丙氨酸
将重组菌bzl01接种在lb培养基中，30℃，220rpm，震荡培养12h，然后转接到含有葡萄糖的发酵培养基中，添加1g/ll-苯丙氨酸底物，发酵36h，合成l-高苯丙氨酸。
发酵结束后，取发酵液500μl，加入等量1mhcl震荡混匀，然后12000r/min离心2分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(hplc)系统检测。检测条件为：30％乙腈-70％水-0.1％三氟乙酸；c18(4.6×150mm)色谱柱；流速1ml/min；进样量10μl；柱温室温；紫外检测器，检测波长210nm。
经过检测，重组菌bzl01以1g/ll-苯丙氨酸为底物，可生成894mg/ll-高苯丙氨酸。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
<110>天津大学
<120>一种3-苯基马来酸异构酶及其应用
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