本发明涉及用于头发再生的方法和制剂。
背景技术：
脱发的治疗是公共卫生的一项未得到充分满足的需求。脱发会严重影响个人的自信心和随之而来的生活质量。最近还显示，男性型秃发与尤其是在头皮区域中的鳞状细胞癌和基底细胞癌的风险增加显着相关(li等，2016，intjcancer139(12)：2671-2678)。男性和女性均可遭受脱发，约40％的男性在35岁时出现明显的脱发，而约80％的女性在60岁时出现明显的脱发。雄激素源性脱发(aga)是最常见的男性和女性脱发的一种形式，也分别称为男性和女性型秃发。
毛发从毛囊结构生长而来，毛囊结构是浅表上皮的多层，成角度的内陷。毛囊单位由间充质和上皮来源的细胞群紧密结合组成。毛鳞球的发芽上皮细胞增殖并分化，形成成熟的毛干。间充质成分由成纤维细胞样细胞组成，这些细胞形成位于毛囊单元底部的称为真皮乳头(dp)的形态学单元，以及存在于上皮毛囊成分的外缘周围的真皮鞘(ds)。dp对毛囊发育和循环至关重要。dp细胞的生化信号传导控制表皮成分的细胞动力学以及毛囊的整体物理尺寸。
头发具有其他结构，例如神经、皮脂腺、血液供应和附着的竖立毛细血管肌肉，这些可改变真皮中毛囊的角度。在该肌肉附着到毛囊本身的位置，有一个包含称为多囊细胞的多能上皮干细胞储液的膨出区域。
除了脚底和手掌以及嘴唇以外，人类大多数体表都含有毛囊，据估计，成年人可以拥有约500万个毛囊，其中约有100,000个在头皮上。毛囊的密度从大腿上的每平方厘米约50个到头皮上的每平方厘米多达600个的区域变化。而且，毛囊密度的变化具有发干直径，长度也很不固定，细的柔毛直径约10-30μm，覆盖前额，附近的“末端毛发”的直径约200μm，覆盖头皮。
当表皮的基底细胞形成可见的头发斑块并且真皮成纤维细胞开始在斑块下聚集并分化而形成球形dp时，毛囊的发育就开始了。表皮细胞形成多层的细长柱，称为毛栓，然后在下端变厚，形成毛鳞球，然后毛鳞球将细长的dp包裹起来，发育中的毛囊向下生长到真皮中。继续将毛栓中的上皮细胞分化为确定的层，并产生发干。最后，该发干从皮肤表面突出，并且毛囊达到其最大长度。因此，毛囊的形态发生需要表皮和真皮隔室的密集交流和联合发育。
早就知道，将新鲜分离的dp细胞植入成年皮肤可以重复该发育过程，并诱导由未分化的囊间表皮形成新的毛囊。首次发现这种现象时，便打开了将dp细胞用于诱导全新毛囊的可能性。
已经描述了四种方法，这些方法能够支持细胞数目的扩展，同时还保持dp细胞的毛发诱导潜力，以产生新的毛囊。在第一种方法中，从哺乳动物表皮细胞(角质形成细胞)中收集的条件培养基(cm)或与角质形成细胞的共培养物被证明在多个培养阶段均支持dp细胞数量的扩展和头发诱导表型的维持。第一种方法描述于us5,851,831，jahoda等人(1998，j.invest.dermatol.111：767-75)。第二种方法描述了在增加水平的wnt蛋白或模拟wnt促进信号转导作用的药剂存在下培养dp细胞的方法(参见wo01/74164和kishimoto等，2002，genes&development14：1181-85)。在第二种方法中，将wnt蛋白或其功能片段或其类似物作为纯化产物添加到培养基中，或者通过在生产者细胞中表达重组蛋白并在通过wnt生产者细胞生长而调节的培养基中提供wit蛋白，或与生产者细胞共培养。第三种方法涉及在包含前列腺上皮细胞的培养基和以前列腺上皮细胞为条件的培养基中培养毛发诱导细胞。第四种方法涉及在3d悬滴中培养dp细胞(参见us9,550,976，us9,109,204和higgins等，2013，procnatlacadsciusa110(49)：19679-88)。
然而，也已经显示，当在标准2d培养物中生长时，dp细胞会改变其转录谱并失去其诱导毛发的潜力，这限制了它们治疗aga的潜力。higgins等(2013，同上)描述了在三维(3d)培养物中dp细胞中毛囊诱导性的部分恢复，导致毛囊诱导。us9,109,204描述了聚集dp细胞以促进离体(例如在截肢的毛囊中)毛囊形成的方法。
当前的脱发疗法包括口服和局部治疗以及毛发移植手术。当前可用的口服和局部脱发治疗必须终身使用，并且仅在脱发的早期阶段才有效。美国食品和药物管理局(fda)和欧洲药物管理局(ema)目前仅批准了两种治疗雄激素源性脱发(aga)的药物：局部用米诺地尔和口服非那雄胺。米诺地尔可以减缓脱发的进程并部分恢复头发，但仅对一小部分男性和女性有效且昂贵。即使对于那些有反应的个体，也必须维持治疗以维持疗效。米诺地尔也可能在施用部位引起刺激和/或过敏反应。非那雄胺仅对男性有效，然后仅对一部分男性有效。非那雄胺还可能引起长期性副作用，例如性欲降低和勃起功能障碍。在中止治疗后6到12个月内，对头发生长的任何有益效果都将消失。
脱发也可以通过将毛囊从预计不会受到aga影响的区域移植到发生脱发的区域(例如，头皮的额部，中部头皮和头顶区域)来治疗。然而，可用于移植的囊数目受到限制，并且移植后受试者仅留有相同数量的头发，因为头发仅从高到低的头发密度区域分布。同样，在刚开始显示aga头发移植效果的男性中，由于受影响区域和未受影响区域的边界尚不清楚，因此通常不适合使用。因此，合适的患者和可用供体毛发的数量限制了毛发移植的有效性。然而，尽管这项手术有局限性，但2016年全球仍有超过500,000例手术性头发修复手术，创造了41亿美元的市场。
2015年，国际毛发修复外科医师协会(ishrs)进行的一项调查发现，毛发移植患者最普遍的抱怨是，最终的头发密度低于预期(占所有抱怨的57％)，或者脱发是在移植后发生的(占抱怨的39％)。毛发移植被认为是“毛发修复”，因为只有当特定患者正确认识到脱发的界限时，才可以进行毛发移植。因此，大约80％的男性移植患者超过30岁，并且已经遭受了严重的脱发。
技术实现要素：
总体上，本发明涉及通过例如将雄激素非抑制细胞引入患病区域而使例如由于雄性或雌性雄激素源性脱发而微型化的毛囊的细胞再生的方法，由此雄激素非抑制细胞至少部分地替代了失去的雄激素抑制细胞，从而增加了发干直径和表观的毛发密度，从而至少部分地反转了脱发的外观。
在一个方面，本发明涉及使毛囊再生的方法，该方法包括以下步骤：(1)从毛囊组织中获得雄激素非抑制细胞；(2)在适于增殖的条件下培养步骤(1)中获得的雄激素非抑制细胞，以产生扩大的雄激素非抑制细胞群；以及(3)将步骤(2)中产生的扩大的雄激素非抑制细胞群植入微型化和/或小型化毛囊附近，从而使微型化和/或小型化毛囊再生。
雄激素非抑制细胞可以是雄激素不敏感细胞，例如其中毛囊组织是头皮毛囊组织。
备选地，雄激素非抑制细胞是雄激素刺激的细胞，例如其中毛囊组织是胡须毛囊组织、胸部毛囊组织、腋部毛囊组织和/或耻骨毛囊组织。
任选地，本发明方法中的雄激素非抑制细胞包含真皮乳头(dp)细胞或由真皮乳头(dp)细胞组成。已显示dp细胞具有特别有效的再生能力。
在本发明方法的步骤(3)中植入的雄激素非抑制细胞可以通过重新激活微型化和/或小型化毛囊的雄激素敏感细胞和/或替换微型化和/或小型化毛囊中的雄激素敏感细胞，使微型化和/或小型化毛囊再生。也可能出现其他使头发再生的机制。
毛囊组织可以被机械地提取，例如使用毛囊单位提取(fue)。备选地，可以使用毛囊单位移植(fut)获得毛囊组织。
本发明的方法可以包括以下步骤：培养雄激素非抑制细胞以使雄激素非抑制细胞的数量增加至少约2至20倍，或至少约500至1000倍，或至少增加一到六个群体倍数。扩大雄激素非抑制细胞的数量会增加用于植入的细胞的数量。
该方法的步骤(1)和/或(2)可以包括例如使用一种或多种生物标志物从毛囊组织中的混合细胞群中选择和/或分离(例如，通过分选)雄激素非抑制细胞的步骤。选择或分选细胞可从细胞群中去除不需要的雄激素敏感细胞。
在本发明的方法中，雄激素非抑制细胞可以在该方法的步骤(1)中从受试者获得，并且在该方法的步骤(2)中培养之后在该方法的步骤(3)中植入同一受试者中，即植入的细胞是自体的。自体细胞将更可能被宿主组织所耐受和/或对于特定个体在毛发再生方面特别有效。顺便说一句，在本发明中还考虑了同种异体细胞的使用。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含雄激素非抑制细胞的体外扩增的群体以使头发恢复活力。雄激素非抑制细胞可具有与本发明方法中使用的那些特征相同的任何特征。
所述组合物的细胞可以来自自体或异体来源，例如相对于用所述细胞治疗的受试者。
所述组合物可以例如由医师或非医师医疗技术人员配制并作为注射剂施用。
该组合物可以用于治疗方法，例如美容治疗方法。
该组合物可以用于使头发生长恢复活力和/或延迟脱发的方法中使用。
该组合物可用于制造用于使头发生长恢复活力和/或延迟脱发的药物。
该组合物可用于施用于患有脱发症的患者，例如雄激素源性脱发。
本发明的组合物可以用于分析毛囊细胞和/或测试化妆品或药物制剂的系统中。
具体实施方式
缩略语
3d三维
5a-dht5-α-二氢睾酮
aga雄激素源性脱发
dht二氢睾酮
dp真皮乳头
ema欧洲药品管理局
fda食品药品监督管理局
fue毛囊单位提取
fut毛囊单位移植。
术语
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于特定的组成或工艺步骤。
美容方法被定义为用于改善个人外观的方法。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学以及杂交相关的术语和技术是本领域众所周知的和常用的。例如，《生物医学和分子生物学简明词典(concisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology)》，juo，pei-show，第二版，2002，crcpress；《细胞和分子生物学词典(dictionaryofcellandmolecularbiology)》，第三版，1999年，academicpress；牛津大学出版社的《生物化学和分子生物学牛津词典(oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)》，修订版，2000年，oxforduniversitypress，为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。
标准技术通常用于组织培养，包括用于在适于增殖的条件下增殖细胞。在具体实施例中提供了用于培养从毛囊组织获得的细胞的合适方法、试剂和条件。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述进行。前述技术和过程通常根据本领域公知的常规方法来执行，并且如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见，例如，sambrook等，分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)(第三版，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港(2001))。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、输送和患者治疗。
在具体实施例中提供了适用于从组织获得雄激素非抑制细胞并植入细胞群的方法。雄激素非抑制细胞可以是雄激素不敏感细胞或雄激素刺激的细胞。雄激素敏感细胞可以例如从头皮的非秃区域获得。雄激素刺激的细胞可以例如从胡须、胸部、腋窝或耻骨区域获得。
如根据本公开所使用的，除非另外指出，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所使用的，术语“和/或”应被视为两个指定特征或部件中的每个的具体公开，具有另一个或不具有另一个。例如，“a和/或b”将被视为(i)a，(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，就像每个都单独列出一样。
术语“一个”或“一种”可以指其修饰的一个或多个元件(例如，“一种试剂”可以表示一种或多种试剂)，除非上下文中清楚地描述是其中一个元素或多于一个元素。
如本文中与任何和所有值(包括数值范围的下端和上端)结合使用的术语“约”是指具有可接受的偏差范围最高为±10％的任何值(及其之间的值，例如，±0.5％，±1％，±1.5％，±2％，±2.5％，±3％，±3.5％，±4％，±4.5％，±5％，±5.5％，±6％，±6.5％，±7％，±7.5％，±8％，±8.5％，±9％，±9.5％)。在一串值的开头使用术语“约”修饰每个值(即“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可以包括90克至110克之间的重量。此外，当在此描述值列表时(例如，约50％，60％，70％，80％，85％或86％)，该列表包括其所有中间值和分数值(例如54％，85.4％)。
发明方面
毛发表现出反复的生长和休息周期。这个周期的三个阶段是生长初期，生长中期和休止期。尽管在某些动物中，这些周期是同步的，但人体上的每一根头发都是异步的，并且处于该周期的自身阶段。生长初期处于生长期，可以持续数月至数年。毛发停留在毛发生长初期的时间越长，其生长的时间就越长。在任何给定时间，人头皮上约有85％的头发处于生长初期。然后，在该生长初期之后是持续约两周的生长中期，在此期间，毛囊的细胞结构退化至其原始长度的约1/6。尽管在此阶段中头发没有活跃地生长，但发干仍然锚固在皮肤中。在生长中期后，毛囊处于休止期，在该期间毛囊保持休眠一到四个月。在某个时候，新的周期开始，毛囊结构再次完全再生。头发的根部会从根部脱落，而旧的发干将脱换。在接下来的生长初期开始的两周内，将开始出现一个新的发干。通常，新发干的大小和结构与上一个周期中产生的发干的大小和结构类似。在人类的平均寿命中，头皮头发将经历大约12个周期。已知该循环是雄激素依赖性的，并且雄激素水平的改变可导致在一个周期与下一周期之间的特定区域中的发干直径和长度的显着改变。例如，在青春期，雄激素水平的变化会导致某些区域的发干直径增加。然而，雄激素也可通过渐进的周期而导致发干直径的减小和毛囊本身的微型化，而在诸如aga的情况下，这种微型化在头皮上最为明显。
并非所有的毛囊都以这种方式对激素作出反应，而aga仅影响某些对雄激素敏感的毛囊。在头皮本身上，这在男性中最为显着，是男性型秃发，其中，头发以渐进的暂时性模式微型化，从太阳穴开始，并散布回整个头皮。从末端状态到绒毛状态的毛囊直径的这种微型化在多个周期中发生。此外，在此小型化过程中，毛囊停留在生长初期或毛囊生长阶段的时间显着减少，因此秃顶的毛囊在毛发休止期，非生长期上花费了大部分的毛囊周期，并且发干长和直径减小。
毛囊的大小和所产生的发干直径由其间充质成分决定，并且已经表明，人类的毛囊dp微型化是随时间推移毛囊中乳头细胞数量减少的直接结果，并且这种减少似乎发生在生长初期与下一个发干的生成之间。
来自不同身体部位的人dp细胞对雄激素的反应性不同。特别地，雄激素(例如，二氢睾酮[dht]或5a-二氢睾酮[5a-dht])刺激例如在腋窝、耻骨区和雄性胡须中的毛囊生长，但是导致患有aga的患者的头皮中的毛囊微型化。一些毛囊对雄激素不敏感，并且在整个生命过程中保持大致相同的大小。因此，人类dp细胞可以归类为雄激素抑制的(例如受aga影响的那些)和雄激素非抑制的。这些雄激素非抑制性dp细胞可进一步细分为雄激素刺激的(例如在男性胡须区域)或对雄激素不敏感的(例如不受aga影响的那些)。
在一个方面，本发明涉及使毛囊再生的方法，该方法包括以下步骤：(1)从毛囊组织中获得雄激素非抑制细胞；(2)在适于增殖的条件下培养步骤(1)中获得的雄激素非抑制细胞，以产生扩大的雄激素非抑制细胞群；以及(3)将步骤(2)中产生的扩大的雄激素非抑制细胞群植入微型化和/或小型化毛囊附近，从而使微型化和/或小型化毛囊再生。
本发明可以涉及用雄激素非抑制性dp细胞，例如雄激素不敏感的dp细胞，来代替微型化和/或小型化毛囊中失去的雄激素敏感性dp细胞，以及增加发干直径。可以认为这是在随后的头发周期中改变了毛囊本身的特性，实际上将受aga影响的毛囊转化为不受aga影响的毛囊。
本发明与现有技术的公开内容的不同之处在于，本发明涉及使用特定的雄激素非抑制细胞来使由于减少了雄激素敏感性细胞的数目而微型化的毛囊再生，从而导致毛囊的直径增加。
雄激素非抑制细胞可以是雄激素不敏感细胞。这些细胞可以从头皮毛囊组织获得。雄激素非抑制细胞可以是雄激素刺激的细胞，并且可以从胡须毛囊组织、胸部毛囊组织、腋部毛毛囊组织和/或耻骨毛囊组织获得。
雄激素不敏感细胞可以从男性受试者获得，例如从头部后部获得。
任选地，本发明方法中的雄激素非抑制细胞包含dp细胞或由dp细胞组成。已显示dp细胞具有特别有效的再生能力。
通过重新激活微型化和/或小型化毛囊的雄激素敏感细胞和/或替换微型化和/或小型化毛囊中的雄激素敏感细胞，在本发明方法的步骤(3)中植入的雄激素非抑制细胞可以使微型化和/或小型化毛囊再生。也可能出现其他使头发恢复活力的机制。
上述与dp细胞培养有关的现有技术方法要求dp细胞通过培养的dp细胞与受体角蛋白细胞的相互作用来维持其诱导形成新毛囊的能力。但是，在现有的微型化毛囊中调节dp细胞的数量代表了另一种策略，可通过修复这些下降的毛囊和恢复这些下降的毛囊的活力来防止脱发。dp细胞功能的实验分析表明，在适当的条件下，植入的小鼠dp细胞能够“归巢”到dp区域，形成嵌合dp并影响发干直径(参见mcelwee等，2003，investdermatol121：1267-1275)。建议在该方法的步骤(3)中植入的雄激素非抑制细胞可能以相同的方式起作用。
本发明方法中使用的毛囊组织可以获自已知或预期包含雄激素非抑制细胞的身体区域。这有利地提供了雄激素非抑制细胞的有效收集。
然而，尽管通常在特定区域发现来自毛囊组织的雄激素非抑制细胞，但是在某些实施方案中，不能单独使用位置来预测毛囊的雄激素响应性。例如，在受aga影响的雄性中，雄激素敏感细胞位于头皮的背面，而在雌性中，脱发模式可能更为弥散。因此，对从头皮毛囊组织获得的细胞进行雄激素敏感性、雄激素非敏感性和/或雄激素刺激的筛选可以包括本发明方法中的另一步骤。以这种方式，仅或主要是雄激素非抑制细胞可以在该方法的步骤(2)中培养或在该方法的步骤(3)中植入。
毛囊组织可以被机械地提取，例如使用毛囊单位提取(fue)。或者，可以使用毛囊单位移植(fut)获得毛囊组织。
在本发明的一个实施方案中，从毛囊组织获得雄激素非抑制细胞包括通过抗体辅助选择从毛囊组织细胞悬液获得雄激素非抑制细胞。这提供了雄激素非抑制细胞的标志物决定性选择。
本发明的方法可以包括以下步骤：培养雄激素非抑制细胞以使雄激素非抑制细胞的数量增加至少约2至20倍，或至少约500至1000倍，或至少增加一到六的群体倍数。扩大雄激素非抑制细胞的数量会增加用于植入的细胞的数量。
该方法的步骤(1)和/或(2)可以包括例如使用一种或多种生物标志物从毛囊组织中的混合细胞群中选择和/或分离(例如，通过分选)雄激素非抑制细胞的步骤。选择或分选细胞可从细胞群中去除不需要的雄激素敏感细胞。
在本发明的一个实施方案中，一个或两个或更多个(例如，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个或更多)基因的表达水平被用作鉴定和/或选择雄激素非抑制细胞的雄激素不敏感性的生物标志物。所述一个或两个或更多个基因可以选自以下：stx17反义rna1；前列腺素i2(前列腺素)合酶；降钙素；蛋白多糖6；整合素β8；x型胶原，α1；瑞林；碳酸酐酶xiii；含有mtor相互作用蛋白的dep结构域；以及hausaugmin样复合亚基6。
已经发现上述基因在雄激素非抑制性dp细胞中以较高的水平表达，但在雄激素敏感性dp细胞中不表达或仅以低水平表达。这些基因提供了雄激素非抑制细胞的高效，准确的鉴定和选择。
可以将其表达或非表达可用作雄激素非抑制细胞或雄激素抑制细胞的生物标志物的其他或替代基因显示在下面的实施例4中(具体地，在表1和列表a-d中)。生物标志物可以例如是ston1(stonin-1)，cyb5r3(编码细胞色素b5还原酶3)和/或srd5a1(编码类固醇5α还原酶1)。
为了比较目的，可以测试本领域已知的合适对照基因的表达或不表达。
本发明方法的步骤(1)和/或(2)可以包括使用生物标志物为雄激素非抑制细胞选择或分选细胞。选择或分选细胞可从细胞群中去除不需要的雄激素敏感细胞。
本发明方法的雄激素可以是二氢睾酮(dht)和/或雄激素非抑制细胞可以是人的。
在本发明的方法中，雄激素非抑制细胞可以在该方法的步骤(1)中从受试者获得，并且在该方法的步骤(2)中培养之后在该方法的步骤(3)中植入同一受试者中，即植入的细胞是自体的。自体细胞将更可能被宿主组织所耐受和/或对于特定个体在毛发再生方面特别有效。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含用于毛发再生的雄激素非抑制细胞的体外扩增群体。雄激素非抑制细胞可具有与本发明方法中使用的那些特征相同的任何特征。
所述组合物的细胞可以来自自体或异体来源，例如相对于用所述细胞治疗的受试者。
所述组合物可以例如由医师或非医师医疗技术人员配制并作为注射剂施用。
该组合物可以用于治疗方法，例如美容治疗方法。
该组合物可以用于使头发生长恢复活力和/或延迟脱发的方法。
该组合物可用于制造用于使头发生长恢复活力和/或延迟脱发的药物。
该组合物可用于施用于患有脱发症的受试者，例如雄激素源性脱发。此用途可能完全是化妆品。
本发明的组合物可以用于分析毛囊细胞和/或测试化妆品或药物制剂的系统中。
在此引用的每个专利、专利申请、出版物和文件的全部内容以相同的程度通过引用并入，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用具体地和单独地被并入本文中一样。引用上述专利、专利申请、出版物和文档并不意味着承认上述任何内容都是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文档的内容或日期的承认。
本文说明性地描述的技术可以在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下适当地实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个都可以用其他两个术语中的任一个代替。已采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性的，并且此类术语和表达的使用不排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，并且在要求保护的技术的范围内可以进行各种修改。
在不脱离本技术的基本方面的情况下，可以对前述内容进行修改。尽管已经参考一个或多个特定实施方案对本技术进行了详细描述，但是本领域普通技术人员将认识到可以对本申请中具体公开的实施方案进行改变，但是这些修改和改进在技术的范围和精神内。
下面更详细地提供与本文公开的发明有关的其他方面、实施方案、特征等。
实施例
给出以下实施例，包括进行的实验和获得的结果，以说明本发明的实施。它们无意于限制或限定本发明的整个范围。
实施例1：使用毛囊单位移植(fut)获得毛囊样品
使用fut手术程序获得毛囊细胞(参见bernstein&rassman，2005，dermatologicclinics23(3)：393-414)。从身体的雄激素非抑制区域(例如头部的后部)取下一小条组织，从中可以提取供体毛囊。然后，从该条上收获单个毛囊。将毛囊冷冻保存以备将来使用或进一步显微解剖以便进行培养(另见实施例3)。毛囊单位是完整厚度的，因此具有表皮、真皮和真皮脂肪组织。
每个毛囊单元都从毛囊下部周围的任何粘附性脂肪或结缔组织中修剪下来，露出位于毛囊底部的末端球囊。用一把剪刀将毛囊横穿乳头上方的基质，以隔离末端球囊。切下端部球囊后，按照higgin等人的描述，从真皮鞘的囊中分离出真皮乳头(dp)(2017，br.j.dermatol.176(5)：1259-1269)。更详细地讲，每个毛囊都刚好在真皮乳头上方横切，以隔离末端球囊。通过将27g针压在切好的顶部上并将其固定在培养皿上，将端部球囊固定在适当的位置。另一只手握住第二个27g针，将其轻轻推过末端球囊的圆形底部，以使结构翻转并使dp露出。用针的锐利边缘将玻璃状膜包围的dp移开，并转移到新鲜培养皿中的50ul胶原酶滴中。将每个dp以类似的方式解剖，并放入其自己的50ul胶原酶滴中，并孵育30分钟。这样可以使dp粘附在培养皿上，但不会溶解玻璃状膜。然后使用2ml的dmem补充10％fbs，2mml-谷氨酰胺(invitrogen，目录号25030)，小心地将dp添加到每个培养皿中，注意不要移开dp，并且在不移动的情况下在10％co2培养箱中在37℃下，培养皿培养10天。然后按照实施例3所述将dp细胞连续传代。
在替代实施方案中，通过机械和/或酶处理从毛囊单元分离细胞。成纤维细胞、角质形成细胞和脂肪细胞很容易通过分解fut获得的样品进行分离。使用本领域技术人员已知的几种技术可以容易地完成分解。这样的技术的实施例包括但不限于机械分解和/或用消化酶和/或螯合剂处理，所述酶和/或螯合剂削弱了相邻细胞之间的连接，从而可以将组织分散到单个细胞的悬浮液中而没有明显的细胞破损。机械破坏可以通过许多方法来完成，包括但不限于使用振动器或旋转器。在一个实施方案中，酶解离是通过切碎组织并用胰蛋白酶处理切碎的组织来实现的。可以单独使用或组合使用多种消化酶中的任何一种，例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性蛋白酶，透明质酸酶，dnase，链酶和/或分散酶。一旦来源组织减少到单个细胞的剩余量，就可以在选择性培养基中培养细胞，以生长角质形成细胞、成纤维细胞、脂肪来源的细胞、间充质细胞类型或任何其他细胞类型。
实施例2：通过毛囊单位提取(fue)获得毛囊样品
在fue中，每个毛囊单位均直接从体内雄激素非抑制区域(例如头皮后方、胡须区域或预期的雄激素非抑制毛囊的其他区域)中单独取出，而未去除任何组织条带。使用与实施例1中所述相同的方法来分离用于分析或培养的dp(参见实施例3)。
实施例3：雄激素非抑制细胞的培养
从获自fut的非秃顶(对雄激素不敏感)区域的毛囊活检中分离出雄激素非抑制细胞(如实施例1中所述)。在补充了10％fbs，2mml-谷氨酰胺(invitrogen，目录号25030)，1％abam的dmem中，将雄激素非抑制细胞在培养物中连续扩增2至1000倍。每2-3天更换一次培养基。当培养物达到融合时，将细胞冷冻，扩增或用于要施用于患者的组合物中。一旦细胞生长良好，就使用标准细胞培养技术以1：2至1：5的比例传代培养它们。
将与上述相同的方法用于实施例2中获得的雄激素抑制细胞的培养。
在另一个实施方案中，雄激素非抑制细胞在培养物中扩增2至100倍(至少)。角质形成细胞获得自毛囊在细胞培养插入物的微孔膜上的移植，该细胞培养插入物在其下表面带有由105个有丝分裂后的人真皮成纤维细胞制成的预形成的饲养层，如limat等人所述(1989，j.invest.dermatol.92(5)：758-62)。培养基包括dulbecco改良的eagle培养基(dmem；invitrogen，目录号1960)/f12(3：1)，补充了10％胎牛血清(fbs；invitrogen)，每毫升10ng表皮生长因子，每毫升0.4μg氢化可的松，0.1nm霍乱毒素，0.135mm腺嘌呤和2nm三碘甲硫氨酸，最终ca2+的最终浓度为1.5nm。在约2周内，角质形成细胞扩增并达到汇合。用胰蛋白酶/edta0.1％/0.02％将它们解离，然后检查其生存力。它们可以冷冻保存或用于治疗患者的制剂中。一个毛囊生长物在约2周内覆盖了培养表面积的1-2cm2。如果需要，这些细胞可以在相同的培养基中传代以进一步扩增。成纤维细胞是从毛囊的外植体生长物中分离出来的，或者是在对毛囊进行酶促处理后，从单个悬浮液中分离出来的。在这两种情况下，dmem均补充有10％fbs，2mml-谷氨酰胺(invitrogen，目录号25030)和0.1mm(0.7μl/100ml最终培养基体积)2-巯基乙醇(sigma，目录号m7522)，用生长培养基扩增细胞。每2-3天更换一次培养基。当培养物达到汇合时，细胞将被冷冻，扩增或用于要施用于患者的组合物中。相同方法可用于培养雄激素抑制细胞。
实施例4：雄激素非抑制性dp的表征
测试如实施例1中所述分离并如实施例3中所述培养的雄激素非抑制性dp细胞样品的雄激素非抑制细胞的基因表达特征。将其与在实施例2从生长在秃顶区域的边缘中的毛囊获得且在实施例3中所述的相同的条件下培养的培养的雄激素抑制的dp细胞的基因表达特征相比较。
对于此转录组分析，使用rneasyplusmicrokit(qigen)收集rna。使用nugenovationv2，rna用于合成第一链互补dna(cdna)。使用nugenencore生物素模块，将其转换为双链cdna，并用作体外转录的模板以生成crna。然后将crna转移至杂交，并使用affymetrixu133plus2.0阵列(thermofisherscientific目录编号900466)进行扫描。使用转录组分析控制台(tac)软件(thermofisherscientific)进行差异基因表达分析。为了比较目的，测试了本领域已知的合适对照基因的表达或不表达。
在雄激素抑制细胞和雄激素非抑制细胞之间表现出最大水平差异表达的生物标志物(包括非蛋白质编码的mrna转录物的基因转录物，在本文中统称为“基因”)显示在下表1中。
表1：培养的雄激素抑制细胞和雄激素非抑制细胞中最大差异表达的基因
表1显示了在一种细胞类型(“+”)中与另一种细胞类型相比表达最高的基因
在下面(清单a)中示出了与雄激素抑制细胞相比，在雄激素非抑制细胞中表达高出10倍以上的基因(除上表1所示的以外)：
核因子i/b；rap鸟嘌呤核苷酸交换因子6；cugbp，类似elav的家族成员2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1；rab27b，ras癌基因家族成员；转移抑制物1；髓磷脂碱性蛋白；半胱氨酸蛋白酶募集结构域家族，成员10；胞质分裂捐赠者4；转录因子7样2(t细胞特异性，hmg盒)；dead(asp-glu-ala-asp)盒多肽52；gtpase，imap家族成员2；人类婆罗双树样转录因子2；肌醇1,4,5-三磷酸肌醇受体，3型；具有序列相似性的家族132，成员b，高迁移率组at-钩子1；kazrin，周质蛋白中的终止蛋白；gdnf诱导的锌指蛋白1；谷胱甘肽过氧化物酶3；秘密粒蛋白ii；x染色体开放阅读框23；formin同源性2结构域包含3；四跨膜蛋白12；蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，e；凝血因子ii(凝血酶)受体样2；核糖核酸酶p/mrp40kda亚基；富含亮氨酸的重复序列包含32；乳胶；锌指蛋白184；脑和急性白血病，细胞质；神经细胞粘附分子1；支链氨基酸转氨酶1，胞质；钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2，β；线粒体钙摄取家族，成员3；荷马支架蛋白2；nadh脱氢酶(泛醌)fe-s蛋白1，75kda(nadh-辅酶q还原酶)；毛囊抑素样1；vitrin；赖氨酸(k)特异性脱甲基酶4b；长的基因间非蛋白质编码rna520；核因子i/b；kelch样的家族成员20；密蛋白1；与ras相关的gtp结合d；碱核蛋白1；丛蛋白结构域包含1；转化生长因子β受体iii；与阿霉素耐药有关；dnaj(hsp40)同源物，亚家族c，成员12；腱蛋白样1；钠通道，电压门控，ii型α亚基。
下面(清单b)中示出了与雄激素非抑制细胞相比在雄激素抑制细胞中表达高出十倍以上的基因(除上表1所示的以外)：
ahnak核蛋白；丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂，进化枝e(连接蛋白，纤溶酶原激活物抑制剂类型1)，成员2；赖氨酰氧化酶；突触结合蛋白样扩展蛋白2；含有纤维蛋白样细胞外基质蛋白1的egf；vi型胶原蛋白，α1；蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型11；xii型胶原蛋白，α1；真核翻译延伸因子1δ(鸟嘌呤核苷酸交换蛋白)；转移抑制子1样；踝蛋白1；tsc22域家族，成员2；胰岛素样生长因子结合蛋白5；盘状蛋白，cub和lccl结构域包含2；转化生长因子β2；突触足蛋白2；脱氢酶/还原酶(sdr家族)成员7；consortin，连接蛋白分选蛋白；微管相关的单加氧酶，钙蛋白和lim结构域包含2；线粒体核糖体蛋白l41；核糖体蛋白s19；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1；vi型胶原蛋白，α1；fk506结合蛋白1a；细胞周期蛋白k；was蛋白家族，成员2；凌乱样激酶1；mdm2原癌基因，e3泛素蛋白连接酶；血影蛋白，β，非红细胞生成1；热激蛋白，α-晶状体蛋白相关，b6；rab5a，ras癌基因家族成员；卡尔德斯蒙1；糖原合酶激酶3β；同源结构域相互作用蛋白激酶3；l/x核因子(ccaat结合转录因子)；聚嘧啶束结合蛋白3；带电的多囊泡体蛋白4b；ptprf相互作用蛋白，结合蛋白1(脂蛋白β1)；wd重复和socs盒包含1；dnaj(hsp40)同源物，亚家族b，成员4；alkb同源物7；gtpase激活蛋白(sh3结构域)结合蛋白1；微管相关蛋白1a；cklf样marvel跨膜结构域包含6；mdm2原癌基因，e3泛素蛋白连接酶；t-复合体11，睾丸特异样2；rhogdp离解抑制剂(gdi)α；ww域包含带有盘绕线圈的适配器；f盒蛋白32；at富交互式结构域5b(mrf1样)；grpe样2，线粒体(大肠杆菌)；转移相关的肺腺癌转录本1(非蛋白质编码)；极光激酶a相互作用蛋白1；泛素结合酶e2h；af4/fmr2家族，成员4；qki，含kh结构域，rna结合；钙调神经磷酸酶1的调节剂；abl相互作用因子2；p21蛋白(cdc42/rac)激活的激酶2；rab11b，ras癌基因家族成员；myc相关因子x；与发芽相关，evh1结构域包含2；真核翻译起始因子4γ，3；无名指蛋白(c3h2c3型)6；核糖体蛋白，大，p2；v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物2；锌指，dhhc型包含20；组蛋白簇1，h1e；透明质酸合酶3；淀粉样β(a4)前体样蛋白2；氧固醇结合蛋白样8；异核核糖核蛋白h1(h)；otu去泛素酶4；隔蛋白11；cd44分子(印度血型)；细胞骨架相关蛋白4；依赖于mg2+/mn2+的蛋白质磷酸酶，1k；v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物3；神经纤维蛋白2(merlin)；atpase，h+转运，溶酶体辅助蛋白2；赖氨酸(k)特异性脱甲基酶4b；slain基序家族成员2；转化生长因子β2；锌指蛋白460；双丝肌动蛋白结合蛋白1；突触小体相关蛋白23kda；富含星形胶质细胞的磷蛋白15；氨基葡萄糖氨基(n-乙酰基)转移酶4，核心2；af4/fmr2家族，成员1；rna聚合酶ii相关蛋白3；脯氨酸丰富14；vi型胶原，α1；蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型11；磷酸二酯酶1c，钙调蛋白依赖性70kda；锌指，cchc结构域包含7；pdz和lim域4；5-氮胞苷诱导2；热激蛋白，α-晶状体蛋白相关，b6；ras同源物富含脑假基因；核糖体蛋白l27；肌营养不良蛋白聚糖1(肌营养不良蛋白相关糖蛋白1)；蛋白激酶n2；小窝蛋白2；deafi(asp-glu-ala-flis)盒解旋酶9；未表征的loc105374954；酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，ε；nck相关蛋白1；跨膜蛋白259；溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白，y+系统)，成员1；肌糖蛋白β；b双引物1，rna聚合酶iii转录起始因子iiib的亚基；赖氨酸(k)特异性甲基转移酶2c；阿司匹林；溶质载体家族6(神经递质转运蛋白)，成员6；ik细胞因子，hlaii的下调剂；跨膜和卷曲螺旋结构域6；trove域家族，成员2；肿瘤坏死因子受体超家族，成员11b；中心体蛋白89kda；蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体12型；动力蛋白，胞质1，重链1；膜联蛋白a2；色谱盒同系物5；cdv3同源物(小鼠)；线粒体核糖体蛋白l52；gata锌指结构域包含2a；rab7a，ras癌基因家族成员；traf型锌指结构域包含1；转化生长因子β2；h3组蛋白，家族3a；蛋白磷酸酶4，调节亚基3a；蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体12型；核糖体蛋白l5；小核仁rna，h/aca盒66；跨膜蛋白259；异氰酸酯2-硫酸酯酶；atpase，vi类，11b型；成纤维细胞生长因子受体底物2；转录因子ap-2alpha(激活增强子结合蛋白2α)；rna结合蛋白，fox-1同源物(秀丽隐杆线虫)2；酸性核磷蛋白32家族成员a；线粒体螺旋核糖体蛋白l41；白介素6信号传感器弹性体核糖核酸酶z2；未表征的loc101926943；跨膜蛋白33；信号序列受体，γ(易位子相关蛋白γ)；氯化物细胞内通道4；根蛋白；钙网蛋白；含有e3泛素蛋白连接酶1的hect域；跨膜蛋白223；大抑癌激酶1；硫丹α；同源结构域相互作用蛋白激酶2；蛋白激酶c，iota；分裂4的转导蛋白样增强子；锌指ccch型，抗病毒1样；schlafen家族成员5；锌指，an1型结构域5；精子特异抗原2；dead(asp-glu-ala-asp)盒解旋酶17；动力蛋白，细胞质1，轻质中间链2；神经元导航器3；含去磷酸coa激酶的结构域；iva型蛋白酪氨酸磷酸酶，成员1；甲硫氨酸腺苷基转移酶ii，β；蛋白激酶，依赖camp，催化，α；异核核糖核蛋白u样1；ras同系家族成员a；tbc1域家族，成员2b；血小板-白细胞c激酶底物同源结构域，家族a，成员2；液泡蛋白分选53同源物(酿酒酵母)；cbp/p300相互作用的反式激活剂，具有富含glu/asp的羧基末端结构域，2；蛋白磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基14a；γ-谷氨酰羧化酶；纤维蛋白1；小染色体维持9同源重组修复因子；溶质载体家族39，成员9；与拓扑异构酶ii同源物1相关的蛋白质(酵母)；蛋白磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基2；连环蛋白(钙黏着蛋白相关蛋白)，β1；n-b同源(果蝇)；lsm12同源物；依赖于mg2+/mn2+的蛋白质磷酸酶，1k；微管相关蛋白4；taf9brna聚合酶ii，tata盒结合蛋白(tbp)相关因子，31kda；腱蛋白跨膜蛋白3；myb/sant样dna结合结构域包含4，带卷曲螺旋；胆绿素还原酶a；wwtr1反义rna1；yip1域家族成员5；磷酸甘油激酶1；丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸相互作用蛋白；跨膜蛋白165；染色体5开放阅读框15；st3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶6；氨基葡萄糖(n-乙酰基)-6-硫酸酯酶；圆盘，大同系物1(果蝇)；tpt1反义rna1；血液学和神经学表达1；磷脂酰肌醇-4-磷酸酯酶3-激酶，催化分解亚基2型α；外囊复合物成分5；核散斑组件转录1(非蛋白质编码)；组蛋白簇1，h2ae；gtpase激活蛋白(sh3结构域)结合蛋白2；囊泡相关膜蛋白5；eh结构域包含2；神经元导航器3；未表征的loc100506403；矮子相关转录因子1；spt6同源物，组蛋白伴侣；脱去异肽酶2；组蛋白簇2，h2aa3；组蛋白簇2，h2aa4；at富交互式结构域5b(mrf1样)；与traf家族成员相关的nfkb激活剂；dead(asp-glu-ala-asp)盒解旋酶3，x连锁；嗜生病毒整合位点5；f盒蛋白32；外泌体成分3；神经氨酸神经营养因子；线粒体核糖体蛋白s12；易位的启动子区域，核篮蛋白；未表征的loc100506403；矮子相关转录因子1；rhogtpase激活蛋白1；胰腺祖细胞分化增殖因子；ski样原癌基因；arp2肌动蛋白相关蛋白2同源物(酵母)；cd46分子，补体调节蛋白；atpase13a3型；电压依赖性阴离子通道3；激活转录因子6β；腱生蛋白xb；三肽基肽酶ii；肢体和中枢神经系统表示1样；钙结合蛋白；myc相关的锌指蛋白(嘌呤结合转录因子)；锌指，mym型5；内皮pas结构域蛋白1；赖氨酰氧化酶像2；富马酸盐水合酶；6-磷酸葡萄糖酸内酯酶；三甲基鸟苷合酶1；谷氨酰脯氨酰trna合成酶；vma21液泡h+-atpase同源物(酿酒酵母)；adamts样4；激酶(prka)锚蛋白13；髓细胞白血病1；rab35，ras癌基因家族成员；ctd小磷酸酶样2；鸟苷酸激酶1；核受体亚家族2，c组，成员2；蛋白磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基11；前列腺素i2(前列环素)受体(ip)；dead(asp-glu-ala-asp)盒解旋酶42；分泌型载体膜蛋白1；前列腺素e受体3(亚型ep3)；3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1；af4/fmr2家族，成员4；prkc，凋亡，wt1，调节剂；丛蛋白a3；神经元神经营养因子；盘状蛋白结构域受体酪氨酸激酶2；kiaa0430；16号染色体开放阅读框72；dead(asp-glu-ala-asp)盒解旋酶3，y联；一般转录因子iia1；跨膜9超家族成员3；分类连接蛋白19；fch域仅2；tox高机动性组盒家族成员4；nop16核仁蛋白；钩微管束缚蛋白3；锌指蛋白460；ap2相关激酶1；ikbke1的抑制子；rpa相互作用蛋白；锌指蛋白，x联，锌指蛋白y联；鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(g蛋白)，q多肽；rhogtpase活化蛋白35；血影蛋白，β，非红细胞生成1；fcf1rrna加工蛋白；基质金属肽酶24(已插入膜)；酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白ζ；视黄酸受体，β；连环蛋白(钙粘蛋白相关蛋白)，α1；磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶，i型，α；富含亮氨酸的重复序列包含28；与锌指结构域1b相邻的溴结构域；卷曲螺旋结构域包含186；磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶，i型，α；密度调节蛋白；bub3有丝分裂检查点蛋白；肌醇单磷酸酶结构域包含1；la核糖核蛋白结构域家族，成员4b；聚(a)聚合酶α；sp3转录因子；激活转录因子1；短螺旋线圈蛋白；富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子10；网格蛋白，轻链b；肌腱1；转移相关的肺腺癌转录本1(非蛋白编码)；中性鞘磷脂酶激活相关因子；肌糖δ；早期内体抗原1；ran结合蛋白1；钙调蛋白1(磷酸化酶激酶，δ)，钙调蛋白2(磷酸化酶激酶，δ)；程序性细胞死亡1配体2；tousled样激酶1；染色体1a的结构维持；转化生长因子β受体ii；组胺n-甲基转移酶；lyr基序包含2；磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶，催化亚基2型α；酪蛋白激酶1，α1；cub结构域含有蛋白1；微管不稳定蛋白2；sp110核体蛋白；硫氧还蛋白相关跨膜蛋白1；蛋白酶丝氨酸23；pdz和lim结构域5；四三肽重复结构域37；同源结构域相互作用蛋白激酶3；中心体蛋白89kda；锌指，bed型包含6；抑制素βa；丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶2；与ighm增强子3结合的转录因子；dickkopfwnt信号通路抑制剂3；成纤维细胞生长因子14；组蛋白簇1，h2bf；热休克蛋白90kdaα(胞质)，b类成员1；ras同源家族b成员；u2af同源基序(uhm)激酶1；钙铝蛋白；akirin2；与ighm增强子3结合的转录因子；跨膜和四肽重复序列含3；相关的ras病毒(r-ras)致癌基因同源物2；泛素特异性肽酶34；生长停滞和dna损伤诱导β；囊泡相关膜蛋白2；溶质载体家族12(钾/氯化物转运蛋白)，成员6；视黄醇脱氢酶10(全反式)；slain基序家族成员2；磷脂酰肌醇结合网格蛋白装配蛋白；溶质载体族8(钠/钙交换剂)，成员1；卷曲螺旋结构域包含88a；vps35重组体复合物组分；精氨酸-trna合成酶2，线粒体；set结构域包含2；蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，a；聚合酶(rna)ii(dna定向)多肽a，220kda；cd46分子，补体调节蛋白；锌指蛋白460；赖氨酸(k)特异性甲基转移酶2d；酪蛋白激酶1，δ；at丰富的交互结构域1a(swi样)；timp金属肽酶抑制剂3；神经酰胺合酶6；母体表达3(非蛋白编码)；ahnak核蛋白2；琥珀酸脱氢酶复合物，c亚基，整合膜蛋白，15kda；跨膜和卷曲螺旋结构域3；rab6a，ras癌基因家族成员；dead(asp-glu-ala-asp)盒解旋酶3，x联；yth域包含1；s期激酶相关蛋白2，e3泛素蛋白连接酶；锌指rna结合蛋白；无翼型mmtv集成站点家族，成员5b；硒蛋白t；与cdk2相关的滞蛋白结构域1；异核核糖核蛋白d样；trove域家族，成员2；y盒结合蛋白3；无名指蛋白141；未表征的loc100506403，与矮子相关的转录因子1；jumonji结构域包含1c；核因子i/x(ccaat结合转录因子)；acta2反义rna1；ras关联(ralgds/af-6)域家族成员3；tsc22d1反义rna1；微管相关蛋白1a；痉挛性截瘫20(troyer综合征)；丝氨酸/苏氨酸激酶3；slc2a4调节器；序列相似性171的家族，成员b；成纤维细胞生长因子受体2；组蛋白簇1，h2bh；中心体蛋白89kda；af4/fmr2家族，成员4；皮质激素；分裂4的转导蛋白样增强子；序列相似性171的家族，成员b；rab5c，ras癌基因家族成员；nadfi脱氢酶，亚基6(复合体i)；酪氨酸蛋白磺基转移酶2；g1到s相变1；udp-葡萄糖糖蛋白葡萄糖基转移酶2；胶原，xii型，α1；建立姐妹染色单体内聚n-乙酰基转移酶1；裂解和聚腺苷酸特异性因子2；隔蛋白9；dnaj(hsp40)同源物，亚家族b，成员5；泛素样修饰剂激活酶6；dnaj(hsp40)同源物，亚家族c，成员13；蛋白质酪氨酸磷酸酶，受体类型，g；卡尔德斯蒙1；肌球蛋白va；nadfi脱氢酶(泛醌)fe-s蛋白1，75kda(nadfi-辅酶q还原酶)；锌指蛋白146；紫杉素7样3b；甘露糖苷酶，α，1a级，成员2；u2af同源基序(ufim)激酶1；sosras/rho鸟嘌呤核苷酸交换因子2；丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶5；去异烟酸异麦芽酮糖苷酶2；钙铝蛋白；富含脯氨酸的盘绕线圈2c；搭档细胞粘附分子2；应激诱导的磷蛋白1；腺瘤性息肉病；钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2，β；脑内皮细胞粘附分子；激活的t细胞5的核因子，紧张响应；四三肽重复结构域3；rna结合基序蛋白8a；bcl2样1；前b细胞白血病同源盒2；透明质酸合酶3，utp4小亚基(ssu)进程组组件；热休克蛋白90kdaβ(grp94)，成员1；ran结合蛋白9；神经调节蛋白1；双重特异性磷酸酶1；tsr3，20srrna积累，同源物(酿酒酵母)；nsl1，mis12动力学复合物组件；组蛋白簇1，h2be；同源结构域相互作用蛋白激酶1；det1和ddb1关联1；蛋白激酶，dna激活的催化多肽；三方基团包含8；nα-乙酰基转移酶30，natc催化亚基；富含at的交互式结构域4b(rbp1样)，rna结合基序蛋白34；突触足蛋白2；血小板活化因子乙酰水解酶1b，催化亚基2(30kda)；未表征的loc101243545；elk4，ets结构域蛋白(srf辅助蛋白1)；5号染色体开放阅读框22；sam域和hd域1；晶体蛋白ζ样1；pfid指蛋白20；泛素特异性肽酶12；pdz和lim域7(enigma)；taf9brna聚合酶ii，tata盒结合蛋白(tbp)相关因子，31kda；血小板-白细胞c激酶底物同源样结构域，家族b，成员2；adam金属肽酶结构域9；t细胞活化抑制剂，线粒体；mis18结合蛋白1；ykt6v-snare同源物(酿酒酵母)；无名指蛋白207；schlafen家族成员5；配对相关同源盒1；互生蛋白，β2(肌营养不良蛋白相关蛋白a1，59kda，基本成分2)；耐扭蛋白a相互作用蛋白2；磷酸肌醇-3-激酶，调节亚基2(β)；dcn1，在滞蛋白融合中有缺陷1，结构域包含1；lrrc75a反义rna1；细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白2；核受体亚家族2，f组，成员2；核糖体蛋白l38；hiv-1tat特异性因子1；rab12，ras癌基因家族成员；埃滋蛋白；gm2神经节苷脂激活剂；周缘材料1；细胞因子信号转导抑制子4；钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(maguk家族)；热激转录因子2；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1；转换2β同源物(果蝇)；h2b组蛋白家族，成员s(假基因)，组蛋白簇1，h2bk，组蛋白h2b型f-s样；赖氨酸(k)特异性脱甲基酶1b；ras关联(ralgds/af-6)结构域家族(n端)成员8；r-spondin4；程序性细胞死亡5；痒e3泛素蛋白连接酶；调节核mrna前结构域包含1a；锌指蛋白770；半乳糖激酶1；蛋白磷酸酶3，催化亚基，γ同工酶；溶质载体家族30(锌转运蛋白)，成员4；mrs2镁转运蛋白；kxdl基序包含1；与分泌有关的，与ras有关的gtpase1b；与锌指结构域1b相邻的溴结构域；巢蛋白；fk506结合蛋白1a；凝集素，甘露糖结合，1；突触足蛋白2；层粘连蛋白，α4；双丝肌动蛋白结合蛋白1，双丝1假基因1；锚蛋白2，神经元；细胞周期蛋白依赖性激酶6；i型人免疫缺陷病毒增强剂结合蛋白2；锌指，mynd型包含11；转移抑制子1样；滞蛋白4b；聚合酶(dna定向)，η；信号转导衔接子分子(sh3结构域和itam基序)2；异质核核糖核蛋白u(支架附连因子a)；丝氨酸/苏氨酸激酶4；胰岛素样生长因子结合蛋白2；nop16核仁蛋白；肽基精氨酸脱亚氨酶，ii型；鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(g蛋白)，γ12；小核仁rna，c/d盒3a，小核仁rna，c/d盒3b-1，小核仁rna，c/d盒3b-2，小核仁rna，c/d盒3c；shwachman-bodian-diamond综合征，shwachman-bodian-diamond综合征假基因1；约瑟芬域包含2；wd重复域1；泛素蛋白连接酶e3c；卷曲螺旋结构域包含174；母体表达3(非蛋白编码)；染色体结构解旋酶dna结合蛋白9；脱氢酶结构域包含2；富含亮氨酸的重复序列(在flii中)相互作用蛋白1；met原癌基因，受体酪氨酸激酶；神经纤维蛋白1；v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物3；致死的巨型幼虫同系物1(果蝇)；间隙连接蛋白γ1；cbp/p300相互作用的反式激活剂，具有富含glu/asp的羧基末端结构域，2；sh3和px域2a；原肌球蛋白4；同源结构域相互作用蛋白激酶3；锚蛋白重复结构域19，假基因；醛氢化脱氢酶1家族，成员l2；连接黏附分子3；i型白介素1受体；富含半胱氨酸的疏水域2；序列相似性为168的家族，成员b；血管生成素像1；eh域结合蛋白1；gm2神经节苷脂激活剂；酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，η；红细胞膜蛋白带4.1样1；异质核核糖核蛋白u(支架附连因子a)；过氧化物酶体生物发生因子13；神经纤维蛋白1；与sh3结构域结合的富含谷氨酸的蛋白样3；fgfr1opn端样；富含g的rna序列结合因子1；鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(g蛋白)，α13；atpase，ca++转运，心肌，缓慢抽搐2；胶原，i型，α1；α地中海贫血/智力低下综合征x-连锁；核因子l/x(ccaat结合转录因子)；核因子i/c(结合ccaat的转录因子)；基质抗原3样1(假基因)，基质抗原3样2(假基因)，基质抗原3样3(假基因)；甘露糖苷酶，内切α；i型角蛋白17；atrophin1；rab30，同源基因家族的ras成员；晶状蛋白βb2，晶状蛋白βb2假基因1；phd指蛋白12；未表征的loc100190986；kdel(lys-asp-glu-leu)内质网蛋白保留受体1；具有ph结构域和sh3结合基序2的ralgef；hect，uba和wwe结构域包含1，e3泛素蛋白连接酶；刺痒同系物3；lim结构域包含脂肪瘤中的首选易位伴侣；tmf1调节的核蛋白1；富含嘌呤的元素结合蛋白b；nadh脱氢酶(泛醌)fe-s蛋白8，23kda(nadh-辅酶q还原酶)；包含1的漆酶(多铜氧化还原酶)结构域；突触融合蛋白6；锌指，mynd型包含11；血影蛋白，β，非红细胞1；brick1，scar/wave肌动蛋白成核复合物亚基；与拓扑异构酶ii同源物1相关的蛋白(酵母)；rar相关的孤儿受体a；圆盘，大(果蝇)同系物相关蛋白4；f盒和富含亮氨酸的重复蛋白20；溶质载体家族25(天冬氨酸/谷氨酸载体)，成员13；羧肽酶d；af4/fmr2家族，成员4；神经母细胞瘤扩增序列；细胞色素c氧化酶亚基viic；g延伸因子，线粒体2；核糖-5-磷酸-3-表皮酶，核糖5-磷酸-3-表皮酶样1；具有gtpase结构域、锚蛋白重复序列和ph结构域2的arfgap；泛素特异性肽酶10；胞质分裂捐赠者9；驱动蛋白家族成员1b；赖氨酸(k)特异性甲基转移酶2d；atp结合盒亚家族d成员3；adp-核糖基化因子相互作用蛋白1；sp1转录因子；染色体在细胞分裂1样1中的生物取向；具有fg重复1的arfgap；一般转录因子lii；真核翻译起始因子4e家族成员3；casp8和fadd样细胞凋亡调节剂；亮氨酰trna合成酶；与分泌关联的，与ras有关的gtpase1b；滞蛋白5；聚合酶(rna)ii(dna定向)多肽j4，假基因；wnt1诱导信号通路蛋白3；rab3b，ras癌基因家族成员；γ-氨基丁酸(gaba)b受体，2；iws1同源物(酿酒酵母)；白介素13受体，α1；pdz和lim域7(enigma)；血管内皮生长因子a；引发酶，dna，多肽2(58kda)；心磷脂合酶1；锌指蛋白655；mex-3rna结合家族成员c；间隙连接蛋白α5；酪蛋白激酶1，α1；小伸长复合物ell亚基2的相互作用子；锌指蛋白326；ellisvancreveld蛋白；整合素β1；莫霍克同源盒；减数分裂核分裂5同系物b所必需；dead(asp-glu-ala-asp)盒解旋酶17；v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物2；精子相关抗原9；与papola和cpsf1相互作用的因子；组蛋白簇1，h2aj；热休克转录因子1；白细胞受体簇(lrc)成员8；mdm2原癌基因，e3泛素蛋白连接酶；线粒体核糖体蛋白l30；微管蛋白，β2aiia级；微管蛋白，β2b类iib；高尔基体相关的pdz和包含卷曲螺旋的基序；dna复制和姐妹染色单体凝聚力1；叉头盒03，叉头盒03b假基因；萌芽相关的evh1结构域包含1；具有ph结构域和sh3结合基序2的ralgef；lsm家族成员14b；硫酸皮肤素差向异构酶样；视网膜母细胞瘤结合蛋白9；丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶7；亚甲基四氢叶酸脱氢酶(nadp+依赖)2，亚甲基四氢叶酸环化酶；smg7无意义介导的mrna衰变因子；fk506结合蛋白15；精氨酸risc催化组分2；异核核糖核蛋白u样2；肌膜相关蛋白dead(asp-glu-ala-asp)盒解旋酶17；核糖体蛋白s6激酶，70kda，多肽1；nadh脱氢酶(泛醌)1β亚复合物，7，18kda；mlx相互作用蛋白；gabpb1反义rna1；swi/snf相关，基质相关，肌动蛋白依赖性染色质调节剂，亚家族a，成员1；锌指，mym型6；锌指和btb结构域包含20；旋盖蛋白(肌动蛋白丝)肌肉z线，β；kruppel样因子12；sestrin3；mob激酶激活剂1a；krab盒结构域包含4，锌指蛋白674；磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶，催化亚基β；n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白，γ；丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶7；morn重复包含2；ras同源家族成员j；trpm8通道关联因子1；camp调节的磷酸化蛋白19kda；5'-核苷酸酶，胞外(cd73)；转导蛋白(β)样1x连锁受体1；血影蛋白，β，非红细胞生成1；输入蛋白8；组蛋白簇1，h2bi；丝切蛋白1(非肌肉)；磷酸胞嘧啶转移酶1，胆碱，α；赖氨酸(k)特异性甲基转移酶2a；棕榈蛋白；锌指和btb域包含24；原肌钙蛋白3(普遍存在)；sushi，vonwillebrand因子a型，egf和正五聚蛋白结构域包含1；泛素结合酶e2g2；酸性磷酸酶1，可溶；细胞分裂周期27；木糖基转移酶i；γ-氨基丁酸(gaba)b受体，2；gata锌指结构域包含2b；异氰酸酯2-硫酸酯酶；整合子复合物亚基1；泛素化因子e4b；锚蛋白重复和fyve域包含1；高移动组盒1；taf9brna聚合酶ii，tata盒结合蛋白(tbp)相关因子，31kda；胶原，vi型，α1；泛素特异性肽酶25；sestrin3；f盒和wd重复域包含11；组蛋白簇1，h2ai；突触小体相关蛋白23kda；mrna前加工因子18；精子发生相关5；亨廷顿相互作用蛋白k，富含edrk的小因子2；serf2-c15orf63通读；髓样/淋巴或混合谱系白血病，易位为1；血影蛋白，β，非红细胞1；溶质载体家族3(氨基酸转运蛋白重链)，成员1；信号识别粒子72kda；泛素特异性肽酶32；山梨素和sh3结构域包含3；硫氧还蛋白相互作用蛋白；hoxd反义生长相关的长非编码rna；未表征的loc100506403，与矮子相关的转录因子1；环指蛋白168，e3泛素蛋白连接酶；rad21粘着蛋白复合物成分；序列相似性家族198，成员b；泛素特异性肽酶33；pr域包含2，具有znf域；聚梳组无名指5；gli家族锌指4；整合素α6；胞质接头相关蛋白2；鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(g蛋白)，β多肽4；谷氨酰胺酶；中心体蛋白63kda；电压依赖性阴离子通道1；转录因子dp-1；染色体6开放阅读框106；内酰胺酶，β；herpud家族成员2；大抑癌激酶1；埃滋蛋白；sum01/sentrin特异性肽酶5；伴侣蛋白，包含tcp1，亚基2(β)；锌指蛋白780a，锌指蛋白780b；涂层蛋白复合物亚基γ1；rab23，ras癌基因家族成员；三结构域蛋白家族包含8；rb相关的krab锌指；sema域，免疫球蛋白域(ig)，短碱性域，分泌型(脑信号蛋白)3d；聚合酶i和转录释放因子；视网膜母细胞瘤结合蛋白6；异质核核糖核蛋白h3(2h9)；线粒体核糖体蛋白l19；选蛋白1；原钙粘蛋白γ亚家族a，11；聚嘧啶束结合蛋白1；外泌体成分3；双特异性磷酸酶3；细胞周期蛋白依赖性激酶13；细胞膜调控蛋白2，palm2-akap2通读；px域包含1；rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(gef)12；线粒体核糖体蛋白l57；组蛋白簇1，h2bd；角鲨烯环氧酶；泛素结合酶e2h；泛素特异性肽酶22；生长分化因子15；前列腺素e受体3(亚型ep3)；糖基转移酶样结构域包含1；gaba(a)受体相关蛋白样1；磷脂酰肌醇聚糖锚定生物合成x类；cdc42小型效应器1；基本的螺旋-环-螺旋家族，成员e41；tor信号通路调节剂；ccr4-not转录复合物亚基4；分选连接蛋白25；环指和ccch型域1；端锚聚合酶，trf1-相互作用的锚蛋白相关的adp-核糖聚合酶；卷曲螺旋结构域包含58；网蛋白；戈尔金a8家族，成员a；thump域包含3；甘露糖苷酶，内切α；细胞粘附素3；伴侣蛋白包含tcp1，亚基4(δ)；以及环指和ccch类型结构域2。
在下面(清单c)中示出了与雄激素抑制细胞相比在雄激素非抑制细胞中表达更多的基因，并且在完整的dp细胞(从实施例2中获得的毛囊获得，并按实施例1所述分离)和培养的dp细胞(如实施例1中所述获得)中也发现了这些基因：
spalt样转录因子2；干扰素调节因子1；psmd5反义rna1(头对头)；cttnbp2n模端样；中性鞘磷脂酶激活相关因子；鸟苷酸环化酶1，可溶，β3；胆脂蛋白，角蛋白丝结合；富含亮氨酸的重复序列包含17；核仁蛋白11；谷胱甘肽s-转移酶μ5；蛋白质精氨酸甲基转移酶3；dead(asp-glu-ala-asp)盒多肽23；甲基转移酶样13；醇脱氢酶5(iii类)，chi多肽；红细胞膜蛋白条带4.1样5；谷胱甘肽过氧化物酶3；染色质可达性复合物1；山松醇rna结合家族成员3；转录接头2b；遍在蛋白倍修饰剂1；sp140核体蛋白样；核糖体rna加工36；ben域包含3；缩醛树脂2；带有卷曲螺旋，锚蛋白重复序列和ph域3的arfgap；主要的组织相容性复合体，i，e级；生长停滞特异性7；转运蛋白2，atp结合盒，亚家族b(mdr/tap)；mhci类多肽相关序列b；核糖体蛋白l31；serta域包含4；xage-4蛋白；磷酸弗林蛋白酶酸性簇分类蛋白2；卷曲螺旋结构域包含51；luc7样3mrna前体剪接因子；中心体材料1；泛素结合酶e2d4(推定)；叉头盒p2；形式结合蛋白4；以及泛醇-细胞色素c还原酶结合蛋白。
在下面(清单d)中示出了与雄激素非抑制细胞相比在雄激素抑制细胞中表达更多并且在完整的dp细胞和培养的dp细胞中也表达的基因：
速激肽4(血凝素)；锌指蛋白816；胶质细胞源性神经营养因子；可溶载体家族5(钠/葡萄糖共转运蛋白)，成员2；tp53靶标1(非蛋白编码)；arpc4-ttll3通读，微管蛋白酪氨酸连接酶样家族成员3；盘菌素，cub和lccl域包含2；二酰基甘油脂肪酶，β；乳腺癌雌激素诱导的细胞凋亡2；血清淀粉样蛋白a1，血清淀粉样蛋白a2；saa2-saa4通读；未表征的loc101929450；转录因子3；rna结合基序蛋白33；prkc，凋亡，wt1，调节剂；v-maf禽肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物；粘结蛋白聚糖1；神经元导航器1；过氧化物酶体生物发生因子14；范可尼贫血核心复合物相关蛋白24；锌指蛋白528；sin3a相关蛋白18kda；酪蛋白激酶1，γ1；未表征的loc648987；中心体蛋白290kda；囊外复合成分3样1；晶状蛋白αb；自噬相关4d，半胱氨酸肽酶；蛋白酶体26s亚基，非atpase8；蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体23型；mkl/类心肌素2；痉挛性截瘫11(常染色体隐性遗传)；denn/madd域包含5b；锌指蛋白205；sertad4反义rna1；磷脂磷酸酶相关3；ww域结合蛋白11；艾杜糖苷酶，α-l-；萨尔瓦多家族ww域包含蛋白质1；唾液酸蛋白；涎福林；c型凝集素结构域家族7，成员a；与ras相关的c3肉毒毒素底物1(rho家族，小gtp结合蛋白rac1)；slc2a4调节剂；含有thap结构域，凋亡相关蛋白2；唾液酸蛋白；涎福林；核转录因子y亚基γ；潜在转化生长因子β结合蛋白4；泛素蛋白连接酶e3成分n-识别蛋白3(推定)；未表征的loc105375666；中心体蛋白104kda；锌指蛋白626；锌指同源异形盒3；ilvb(细菌乙酰乳酸合酶)样；锌指和btb域包含7a；三甲基鸟苷合酶1；atlastingtpase3；扭曲原肠胚形成bmp信号调制子1；激活转录因子5；核因子，类红细胞2样2；c2钙依赖性结构域含有4b；转化生长因子β调节剂1；弹性蛋白；动力肌动蛋白1；1-酰基甘油-3-磷酸o-酰基转移酶3；氯化物通道clic样1；带有卷曲螺旋、锚蛋白重复序列和ph结构域2的arfgap；跨膜蛋白259；rna结合基序蛋白14；岩藻糖苷酶，α-l-1，组织；prmt1的染色质靶；elf1同源物，延伸因子1；trpm8通道相关因子1；nhl重复包含2；整合素β1，整合素β1假基因1；四三肽重复域3；倒置的甲精，包含fh2和wh2域；三核苷酸重复序列包含6a；甲硫腺苷磷酸化酶；肌球蛋白，重链11，平滑肌；紫杉醇1；钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii抑制剂1；gtp结合蛋白2；泛素蛋白连接酶e3b；生长早期反应1；肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基5；伴侣蛋白包含tcp1，亚基4(δ)；rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(gef)12；px域包含1；胞质接头相关蛋白2；mrna加工因子18；gabpb1反义rna1；lsm家族成员14b；kxdl基序包含1；r-spondin4；h2b组蛋白家族，成员s(假基因)，组蛋白簇1，h2bk，组蛋白h2b型f-s样；nsl1，mis12线粒体复合成分；热休克蛋白90kdaβ(grp94)，成员1；tsc22d1反义rna1；与ighm增强子3结合的转录因子；sp3转录因子；髓细胞白血病1；tbc1域家族，成员2b；锌指，an1型结构域5；蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体12型；h3组蛋白，家族3a；gata锌指结构域包含2a；ik细胞因子，下调hlaii，跨膜和卷曲螺旋结构域6；蛋白激酶n2；ets变体5；以及胶原蛋白，vi型，α1。
可从清单c和d中选择一个或两个或多个基因，以用于培养细胞的质量控制(qc)测试，以确认它们是否是雄激素非抑制的。清单c中的基因可能是特别有用的，因为它们可以区分雄激素抑制细胞和雄激素非抑制细胞，例如在完整的dp中，在培养中扩增前或在培养了细胞后。表达细胞表面蛋白的分化基因也可以用作多种细胞分离技术的抗原。
对于上述清单a-d中的基因，affymetrixu133plus2.0阵列试剂盒中提供了唯一的affymetrixid号和基因记号。
实施例5：雄激素非抑制细胞的鉴定和选择
如实施例4中所述，在扩增细胞的末端和对患者的临床使用之前，对细胞进行了评估以进行生物标志物的表达。特别是，使用表1和/或清单a-d列出的基因，可以区分雄激素非抑制细胞、毛囊诱导细胞和雄激素敏感细胞。可以出于比较目的测试本领域已知的合适对照基因的表达或不表达。
阳性或阴性选择所需的雄激素非抑制细胞，或同时选择两者。前一种方法旨在从整个种群中分离雄激素非抑制细胞类型，而后一种策略涉及从种群中耗竭雄激素抑制细胞，从而仅保留雄激素非抑制细胞。表面抗原与抗体或适体的特异性结合可以选择性地捕获细胞，其中差异表达的基因(例如，如实施例4中公开的)编码细胞表面蛋白(例如整联蛋白)。随后在可测量的探针(例如荧光染料或磁性颗粒)的帮助下检测捕获的细胞，并用其标记抗体/适体。标记后，可使用诸如荧光激活细胞分选facs或磁性激活细胞分选(macs)之类的技术对细胞进行阳性或阴性选择。
实施例6：注射前细胞的制备
培养结束时，准备注射细胞。通过胰酶蛋白化从培养皿中收集细胞，通过离心收集并重悬于hypothermosol-frs(biolife)中。
实施例7：细胞注射
计数在体外扩增的雄激素非抑制细胞，并使用带有27-g针头的微型注射器将其注射到靠近位于头皮秃顶或秃顶前区域中的微型头发的位置。(可通过小至30-g的针头注射细胞，但最好使用27-g的针头)。