一种MSC体外扩增方法与流程

本发明属于细胞扩增技术领域，特别涉及一种msc体外扩增方法。

背景技术：

msc是指间充质干细胞，是干细胞的一种，能分化为间质组织。间充质干细胞因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。间充质干细胞可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。

目前间充质干细胞的主要来源为成人骨髓，但成人骨髓源间充质干细胞细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制，从而使间充质干细胞的临床应用受到限制。因此，发明一种体外扩增间充质干细胞的方法来解决上述问题很有必要。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种msc体外扩增方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种msc体外扩增方法，包括如下步骤：

s01：将mspm膜浸润在水中，制备得到mspm混合液；将间充质干细胞重悬于第一培养基中，制备得到msc细胞悬液；

s02：取mspm混合液，并弃掉上清液，用第二培养基重悬，然后放入培养箱中进行培养，再次弃掉上清液，然后用msc细胞悬液浸润mspm载体，之后补加第一培养基，放入培养箱中进行培养。

优选地，步骤s02中，取mspm混合液，并弃掉上清液，用第二培养基重悬，重悬液加入孔板中，再放入培养箱中培养，再次弃掉上清液后每孔加入msc细胞悬液浸润mspm载体，之后补加第一培养基，将孔板放入培养箱中进行间充质干细胞的培养。

优选地，步骤s02中，在间充质干细胞培养的第1个小时内，每隔15min拿出孔板进行摇晃混匀，在间充质干细胞培养的第3个小时后，补加第一培养基。

优选地，步骤s02中，在间充质干细胞培养的三天后，吸走每个孔中原有的第一培养液，重新加入新鲜的第一培养液。

优选地，所述的培养箱为二氧化碳含量为5％的co²培养箱。

优选地，所述的第一培养基为友康无血清培养基；所述的第二培养基为dmemhg培养基。

优选地，步骤s01中，msc细胞悬液的密度为1*10⁶cells/ml。

本发明的工作原理：本发明采用mspm膜作为载体，对间充质干细胞进行培养，步骤简单，培养效率高。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明采用mspm膜作为载体，其成分是聚对二甲苯，适合长期植入人体，是一种生物相容涂层材料。生物稳定性好、细胞毒性低和还具有抗水解性。

2.本发明发明了一种msc体外扩增方法，能有效的体外扩增msc。

附图说明

图1是本发明在第1天的时候，在显微镜下观察mspm上的msc细胞，物镜的放大倍数4倍的显微镜放大图；

图2是本发明在第6天的时候，在显微镜下观察mspm上的msc细胞，物镜的放大倍数4倍的显微镜放大图；

图3是本发明吸附时间3小时的细胞数量柱状图；

图4是本发明吸附时间3小时的吸附效率的柱状图；

图5是本发明培养时间5天的增值倍数的柱状图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

(1)mspm(载体)混合液的准备：剪取一块mspm膜，面积为1cm²，其长宽各1cm，浸润在4ml纯化水，在121℃，30min的条件下进行灭菌，灭菌后可以在4℃的温度下储存3个月。

(2)msc细胞悬液准备：获取p4代以内的msc，用友康无血清培养基(购于市场)重悬细胞，制成细胞悬液，细胞悬液密度1*10⁶cells/ml，体积500ul，细胞存活率大于85％。

(3)细胞接种：取mspm混合液2ml(混合液中含有mspm膜)，吸走上清，用2mldmemhg培养基(dmem高糖培养基，购于市场)重悬后，混匀，加入超低吸附6孔板后转入co²培养箱(二氧化碳的浓度为5％)。在co²培养箱内孵育30min后，取出6孔板，然后用移液枪弃掉上清，再每孔加入100ulmsc细胞悬液，轻轻摇晃6孔板10s，反复浸润微载体，之后每个孔补加400ul友康无血清培养基，再放入co²培养箱。在第一小时内，每隔15min拿出6孔板在生物安全柜轻轻来回混匀。3小时后，补加友康无血清培养基。取一个孔裂解计数计算吸附率。

(4)细胞观察和换液：继续在co²培养箱培养，第三天，吸走旧培养液，加入新鲜培养液。

(5)细胞收获：第6天，将6孔板中每孔所有悬液和mspm一同吸出，放入15ml离心管中，并加入5mlpbs,在1500rpm的转速下，离心5min；弃上清，加入trpsin(胰蛋白酶)1ml，用离心管轻轻混匀后放入室温(21℃)，放置10min；待显微镜观察细胞全部从mspm脱落后，加入4mlpbs，充分混匀，再次在1500rpm的转速下，离心5min；弃上清，加入100pbs重悬细胞，取20ul细胞悬液与荧光染液1:1混合进行计数，并计算出细胞存活率和细胞总数量，细胞总数量乘以细胞存活率就是细胞收获数量。

实施例1平行3组实验，a组、b组、c组。吸附时间3小时后的吸附率如图4所示，吸附时间3小时的细胞数量如图3所示，培养时间5天的细胞的增值倍数(5天后最终收获数量除以吸附3小时的起始数量就是增值倍数)如图5所示，在第1天的时候，在显微镜下观察mspm上的msc细胞，物镜的放大倍数4倍，如图1所示；在第6天的时候，在显微镜下观察mspm上的msc细胞，物镜的放大倍数4倍，如图2所示。低吸附6孔板直接从市场购买。

mspm膜：是一种多孔的网格薄膜，来自浙大实验室，成分是聚对二甲苯。聚对二甲苯适合长期植入人体，是一种生物相容涂层材料。其生物稳定性好、细胞毒性低和还具有抗水解性。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

技术特征：

1.一种msc体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

s01：将mspm膜浸润在水中，制备得到mspm混合液；将间充质干细胞重悬于第一培养基中，制备得到msc细胞悬液；

s02：取mspm混合液，并弃掉上清液，用第二培养基重悬，然后放入培养箱中进行培养，再次弃掉上清液，然后用msc细胞悬液浸润mspm载体，之后补加第一培养基，放入培养箱中进行培养。

2.根据权利要求1所述的一种msc体外扩增方法，其特征在于，步骤s02中，取mspm混合液，并弃掉上清液，用第二培养基重悬，重悬液加入孔板中，再放入培养箱中培养，再次弃掉上清液后每孔加入msc细胞悬液浸润mspm载体，之后补加第一培养基，将孔板放入培养箱中进行间充质干细胞的培养。

3.根据权利要求1所述的一种msc体外扩增方法，其特征在于，步骤s02中，在间充质干细胞培养的第1个小时内，每隔15min拿出孔板进行摇晃混匀，在间充质干细胞培养的第3个小时后，补加第一培养基。

4.根据权利要求1所述的一种msc体外扩增方法，其特征在于，步骤s02中，在间充质干细胞培养的三天后，吸走每个孔中原有的第一培养液，重新加入新鲜的第一培养液。

5.根据权利要求1所述的一种msc体外扩增方法，其特征在于，所述的培养箱为二氧化碳含量为5％的co²培养箱。

6.根据权利要求1所述的一种msc体外扩增方法，其特征在于，所述的第一培养基为友康无血清培养基；所述的第二培养基为dmemhg培养基。

7.根据权利要求1所述的一种msc体外扩增方法，其特征在于，步骤s01中，msc细胞悬液的密度为1*10⁶cells/ml。

技术总结
本发明提供了一种MSC体外扩增方法，属于细胞扩增技术领域。它解决了目前间充质干细胞的来源受到限制等问题，一种MSC体外扩增方法，包括如下步骤：S01：将MSPM膜浸润在水中，制备得到MSPM混合液；将间充质干细胞重悬于第一培养基中，制备得到MSC细胞悬液；S02：取MSPM混合液，并弃掉上清液，用第二培养基重悬，然后放入培养箱中进行培养，再次弃掉上清液，然后用MSC细胞悬液浸润MSPM载体，之后补加第一培养基，放入培养箱中进行培养。本发明具有能体外扩增MSC等优点。

技术研发人员：曹哲厚;郑海刚;韦俊;吴立前
受保护的技术使用者：杭州原生生物科技有限公司
技术研发日：2020.06.24
技术公布日：2020.09.22