一种石斑鱼精巢人工催熟的方法与流程

本发明涉及石斑鱼养殖技术领域，具体涉及一种石斑鱼精巢人工催熟的方法。

背景技术：

石斑鱼隶属于硬骨鱼纲(osteichthyes)、辐鳍亚纲(neopterygii)、棘鳍总目(acanthopterygii)、鲈形目(perciformes)、鲈亚目(percoidei)、鮨科(serranidae)。由于石斑鱼具有富含营养、肉质鲜美、低脂肪、高蛋白等特点，是人们喜爱的海水鱼珍品。石斑鱼的价格昂贵，具有很高的经济价值，近年来由于近岸滥捕，产量锐减，市场供不应求。在我国南方沿海广东、海南、福建、广西等地石斑鱼已成为海水养殖的主要对象，经济价值巨大。

石斑鱼为典型的雌雄同体雌性先熟鱼类，低龄鱼卵巢先成熟，表现为雌性。随着年龄的增长，卵巢萎缩吸收，性逆转为雄鱼。因此，在人工繁育中往往存在雄鱼缺乏或雌雄亲鱼成熟不同步的现象，此外，很多雄性亲鱼在繁殖季节精巢很难发育成熟产生精子，并且近年来雄鱼产出的精子数量和质量下降明显，由于这个原因导致石斑鱼雄性亲鱼培育难度加大，这严重制约了石斑鱼人工繁育工作的开展。

目前，针对雄性石斑鱼的催熟方法基本没有，主要通过加强营养来促进其精巢的成熟，但是此方法往往效果不佳。通过加强营养来提高其精巢成熟往往操作时间长，而且培养的准确性低，大部分加强营养后还是不能产出高质量精子，同时饲喂方法，生长环境对其影响比较大。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术中通过加强营养来提高雄性石斑鱼的精巢成熟所存在的操作时间长、培养的准确性低的问题，提供一种石斑鱼精巢人工催熟方法，该方法具有准确性高、快速的优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建dmrt1基因真核表达载体：通过克隆获得斜带石斑鱼dmrt1开放读码框，通过双酶切和连接将基因构入真核表达载体，转化到大肠杆菌中扩大培养，提取获得大量带dmrt1基因的真核表达载体；

脂质体包埋真核表达载体：采用脂质体包埋构建好的dmrt1真核表达载体；

选择石斑鱼：在繁殖季节选择不能产生精液的雄性石斑鱼；

注射脂质体包埋的dmrt1真核表达载体：在石斑鱼腹部开微孔，采用微量注射器将脂质体包埋的dmrt1真核表达载体直接注射入精巢；

注射完成后的饲养：注射完放入水泥池饲养，按时投喂高蛋白饵料。

dmrt1(doublesexandmab-3relatedtranscriptionfactor1)是雄性性别分化和性别决定的关键基因，对脊椎动物精巢发育至关重要。在哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类和两栖类等动物中陆续发现了该基因。在小鼠的胚胎中，dmrt1在雌雄生殖期的早期都有表达，随后睾丸中表达量增加，而卵巢中表达量减弱。通过rt-pcr可以在鳄鱼胚胎泌尿系统的早期检测dmrt1的表达。随着性腺的发育，雄性的表达量明显较雌性的高。在鱼类，dmrt1主要在精巢的支持细胞(sertolicells)表达，对精巢的分化、雄性性状的维持和精巢的成熟起关键作用。

本发明在繁殖季节，通过体外构建斜带石斑鱼dmrt1真核表达质粒，并通过脂质体传递入精巢，从而在石斑鱼精巢中过表达dmrt1基因，促使精巢开始精子发生，产生大量成熟精子，达到催熟的目的。

进一步的，构建dmrt1基因真核表达载体步骤中，以斜带石斑鱼精巢总mrna为模板，以rnaoligodt为引物，反转录得到cdna，再以所述cdna为模板，通过pcr扩增引物进行pcr扩增，获得斜带石斑鱼dmrt1开放读码框。

进一步的，所述pcr扩增引物其上游引物和下游引物的序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示。

进一步的，构建dmrt1基因真核表达载体步骤中，采用ecorⅰ和kpnl两种内切酶进行双酶切，采用t4dna连接酶将切开质粒和片段连接起来，所述真核表达载体采用p3×flag-cmv-13载体。

进一步的，构建dmrt1基因真核表达载体步骤中，所述转化到大肠杆菌扩大培养是转化到dh5α感受态，挑取单菌落经测序确定表达载体中的外源基因无误后，将单菌落接种至100ml含100μg/ml氨苄青霉素抗性的lb培养基，37℃，250rpm振荡过夜培养。

进一步的，选择石斑鱼步骤中，选用手推挤腹部不会有精子流出的雄性石斑鱼。

进一步的，注射脂质体包埋的dmrt1真核表达载体步骤中，开微孔选生殖孔往前2.0-4.0cm的位置，用手术刀划开一个微孔，划的长度为0.5-0.8cm。

进一步的，注射脂质体包埋的dmrt1真核表达载体步骤中，注射器针头长度为6-8cm，注射时采用多点注射，每1cm长度性腺注射3ul包埋好的dmrt1真核表达载。

进一步的，注射完放入水泥池饲养，选择圆形水泥池，投喂的饵料选择冰鲜鱼、鱿鱼，分散投喂。

进一步的，脂质体包埋真核表达载体步骤中，采用脂质体lipofectamine3000包埋构建好的dmrt1真核表达载体。

进一步的，在注射后第五天捞取石斑鱼轻轻推挤腹部检测有没有白色精液流出，如果没有则隔天推挤一次，直到第10天为止。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用斜带石斑鱼基因组数据库设计了特异引物，pcr扩增克隆得到dmrt1基因的orf序列，并构建真核表达载体，转化到大肠杆菌中培养，可获得大量带dmrt1基因的重组表达载体；再通过lipofectamine3000包埋载体后注射到石斑鱼精巢中，直接促进精巢的成熟。具有准确性高，催熟效率高，适用范围广的特点。

附图说明

图1为斜带石斑鱼dmrt1开放阅读框的pcr扩增产物电泳结果图。

图2为催熟前和催熟后石斑鱼精巢组织切片图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。

实施例1

一种石斑鱼精巢人工催熟的方法，其包括以下步骤：

(1)构建dmrt1基因真核表达载体

通过克隆获得斜带石斑鱼dmrt1开放读码框，通过双酶切和连接将基因构入真核表达载体，转化到大肠杆菌中扩大培养，提取获得大量带dmrt1基因的真核表达载体，具体方法包括：

a.斜带石斑鱼精巢总rna的提取

取健康雄性斜带石斑鱼全鱼，以冰浴麻醉约2min后，杀鱼取样，分离精巢组织，采用trizol试剂法抽提获得斜带石斑鱼头肾总rna，其od260/280＝1.90。

b.cdna第一链的合成

取1μg斜带石斑鱼头肾总rna样品进行dna酶处理以去除基因组dna的污染，进行反转录，所得产物置于-20℃保存备用。

c.斜带石斑鱼dmrt1基因cdna全序列的克隆

根据斜带石斑鱼基因组数据库中的信息，在dmrt1开放读码框拼接序列两端设计pcr扩增引物，pcr扩增引物其上游引物和下游引物的序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示。

所述seqidno：1的序列为：tgagcaggttcagcagtgaccac。

所述seqidno：2的序列为：gtacactggtgaactgacttcaac。

以步骤b合成的第一链cdna为模板，进行pcr扩增，扩增片段大小为1140bp。电泳分离dna片段，切胶回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pmd18-t载体，转化dh5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。经blast同源性分析表明，目的产物确为dmrt1基因的cdna序列片段。

d.真核表达质粒的构建

以含有dmrt1编码基因的pmd18-t质粒为模板，设计一对含有ndei酶切位点的pcr扩增上游引物如seqidno：3所示，和含有xhoi酶切位点的pcr扩增下游引物如seqidno：4所示。

所述seqidno：3的序列为：

ccggaattcaatgagcaaagataagcagagcaag

所述seqidno：4的序列为：

cggggtaccttttggtggcgtcgccctcgatgatg

经pcr扩增得到产物大小在885bp左右的单一条带，电泳结果如图1所示。在图1中，m为dnamarker，1为带有酶切位点的dmrt1核苷酸目的片段。将斜带石斑鱼dmrt1的orf序列克隆至真核表达载体p3×flag-cmv-13上，构建真核表达载体dmrt1-3×flag。

e.重组表达质粒的扩培和提取

将步骤d中构建的表达质粒转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆测序，表达载体中的外源基因序列经测序鉴定无误。将测序确定后的单菌落接种至100ml含100μg/ml氨苄青霉素抗性的lb培养基，37℃，250rpm振荡过夜培养。第二天采用promega的无内毒素提取试剂盒提取大量带dmrt1基因的真核表达载体。

(2)脂质体包埋真核表达载体：采用lipofectamine3000包装步骤(1)中提取的带dmrt1基因的真核表达载体。具体操作过程如下：

在一个离心管中按照5ulopti-mem^tmmedium加入lipofectamine3000reagent0.3ul的比例混合两者，在另一个离心管中按照5ulopti-mem^tmmedium加入0.5ug载体再加入p3000^tmreagent0.4ul比例混合，然后将两个离心管中的试剂混合，制成载体-脂质体复合物。

(3)选择石斑鱼：在繁殖季节选取养殖的8-10kg的健康雄性斜带石斑鱼，此时用手推挤腹部不能挤出精子，同时通过刮去少量性腺通过组织切片确定每条鱼都是非成熟的精巢。

(4)注射脂质体包埋的dmrt1真核表达载体

将石斑鱼用丁香酚麻醉后用湿毛巾包裹，漏出腹部。用手术刀在生殖孔上方大概2.5cm位置划一个长0.8cm的开口，然后用微量进样器吸取载体-脂质体复合物从开口处进入直接扎到精巢上，多点注射。注射完后用红霉素软膏涂抹伤口，轻轻将鱼放回水泥池中。

(5)注射完成后的饲养

石斑鱼放回水泥池后，当天不要喂食。第二天下午4点后开始投喂冰鲜鱼或者鲜鱿鱼，投喂时饵料尽量分散，不要让鱼抢食受伤。

(6)注射后5天随机捞取3条鱼轻微麻醉后，用手推挤腹部看能不能挤出精液，如有则可以用于繁育。如没有可以过两天再随机捞取三条推挤，直到第10天。

对催熟前的雄性斜带石斑鱼和催熟后的雄性斜带石斑鱼精巢进行组织切片观察，结果如图2所示。在图2中，a为催熟前的精巢组织切片图；b为催熟后的精巢组织切片图。sg为精原细胞；sc为精母细胞；sz为精子。标尺为25ul。

实施例2

本实施方式与实施例1的区别在于：所选择的雄性石斑鱼为赤点石斑鱼，体重为3.0-5.0kg。

验证实验

(一)对实施例1和实施例2所催熟的石斑鱼的催熟率进行统计，结果如下表1所示：

表1采用本发明的方法催熟石斑鱼的催熟率

(二)对采用本发明的石斑鱼精巢人工催熟方法进行催熟处理的石斑石的精子活力进行测定，结果如下表2所示。

表2精子活力测定结果

综合以上表1和表2的检测结果，通过观测样本的结果表明本发明方法具有较高的准确性和较大的使用价值，综合判定准确率达到90％以上。本发明提供的一种石斑鱼精巢人工催熟方法与以往方法比较具有高效准确，催熟效率高，适用范围广等特点。该技术在鱼类育种方面将有显著的经济效益和社会效益。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应局限于该实施例和附图所公开的内容，所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。