一种含有粪产碱杆菌的微生物菌剂及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种含有粪产碱杆菌的微生物菌剂及其应用。

背景技术：

近年来随着经济发展与生活水平的不断提高，人们对肉制品的生活需求不断加大，各大屠宰场都在不断的扩大经营规模，屠宰行业达到了前所未有的扩大与发展，其废水排放量也在不断增加。其中，屠宰废水主要包含来自畜牧、禽类、鱼类等的屠宰行业。据统计，目前我国仅宰猪行业就有1000多家，年排放废水总量达3亿立方米左右，约占全国工业废水排放量的6％。如果此类废水不经处理而直接排放将会对周边水环境造成严重污染，同时对人畜健康也会造成巨大伤害，因此，环保监察部门会强制要求屠宰场必须建立专门的废水处理站，以处理屠宰过程中产生的废水。

屠宰废水本身具有明显特点，首先是其具有很难闻的腥臭味，其次是其颜色一般为红褐色，并且该类废水中还含有大量的血、油脂、动物内脏、皮毛、肉屑、以及动物胃中未消化的食物、粪便等，严重污染与影响社会环境。屠宰废水含有的主要污染因子包括cod、氨氮、油脂与总氮等，该类废水的处理，一直是国家十分重视与头疼的问题之一。

因此，在运用生化处理的方式来处理该类废水的过程中，寻找可高效降解去除该类废水中cod、氨氮与总氮的微生物菌种已成为影响废水达标无害化处理的关键因素之一。

技术实现要素：

本发明提供了一种含有粪产碱杆菌的微生物菌剂及其应用。所述微生物菌剂包括粪产碱杆菌gbw-hb1905菌粉和载体，其具有高效的去除屠宰废水中cod、氨氮与总氮的作用。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种含有粪产碱杆菌的微生物菌剂，所述微生物菌剂包括菌含量不低于5.0×10⁸cfu/g的粪产碱杆菌菌粉和载体。

进一步的，所述粪产碱杆菌菌粉和载体的质量比为1∶50～100。

进一步的，所述粪产碱杆菌菌粉是由保藏编号为cgmccno.20364的粪产碱杆菌gbw-hb1905制备获得的。

进一步的，所述粪产碱杆菌菌粉的制备步骤如下：

(1)将粪产碱杆菌gbw-hb1905接种至改良nb培养基中，在ph7.5-8.5，温度为28℃的恒温摇床中培养22h，得到粪产碱杆菌gbw-hb1905种子液；

(2)将粪产碱杆菌gbw-hb1905种子液按8-10％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.1～0.2mpa，温度28～30℃，溶氧≥25％，搅拌速度为160～180rpm，发酵16～20h，得到粪产碱杆菌gbw-hb1905发酵菌液；

(3)将粪产碱杆菌gbw-hb1905发酵菌液与载体按照1∶2～4的体积质量比进行混合，并在-40～-50℃条件下真空冷冻干燥，得到粪产碱杆菌gbw-hb1905菌粉。

进一步的，所述粪产碱杆菌gbw-hb1905具有耐广盐性，生长盐度范围为15～35‰。

进一步的，所述粪产碱杆菌gbw-hb1905的生长温度为15～40℃，最适生长温度为25-32℃。

进一步的，所述粪产碱杆菌gbw-hb1905的生长ph值为6～9，最适ph值为7.5-8.5。

进一步的，所述粪产碱杆菌gbw-hb1905能够高效降解屠宰废水中污染物中的cod、氨氮和总氮。

进一步的，所述粪产碱杆菌gbw-hb1905繁殖速度快，培养4h后进入对数生长期，14-16h时进入对数生长末期，菌数达到6.0×10⁹cfu/ml。

进一步的，所述粪产碱杆菌gbw-hb1905的适宜生长培养基中包括葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和玉米浆干粉。

进一步的，所述载体为碳酸钙、滑石粉和硅藻土中的至少一种。

本发明还提供了所述的含有粪产碱杆菌的微生物菌剂在制备用于降解屠宰废水中污染物的制剂中的应用。

进一步的，所述微生物菌剂的使用方法为：将所述微生物菌剂直接添加到缺氧池和好氧池中，保持好氧池水中溶氧≥2mg/l，缺氧池水中溶氧≤0.5mg/l，并控制缺氧池和好氧池的ph值为7.0-8.0。

进一步的，所述微生物菌剂在屠宰废水处理系统的缺氧池与好氧池中的添加浓度分别为80-100ppm与180-200ppm。

进一步的，所述污染物包括cod、氨氮和总氮。

进一步的，所述微生物菌剂能够将屠宰废水出水中的cod浓度控制在30mg/l以下，氨氮浓度控制在2mg/l以下，总氮浓度控制在7mg/l以下。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明的粪产碱杆菌gbw-hb1905分离自含高盐废水的水体环境中，其具有耐盐生长特性，在15～35‰的盐度范围内均能生长良好。由粪产碱杆菌gbw-hb1905经培养发酵得到的菌粉与载体相混合可制备得到微生物菌剂。该含有粪产碱杆菌gbw-hb1905的微生物菌剂具有快速降解屠宰废水中cod、氨氮与总氮的能力，并能够将屠宰废水出水中的cod浓度控制在30mg/l以下，氨氮浓度控制在2mg/l以下，总氮浓度控制在7mg/l以下。因此，该微生物菌剂可用于开发去除屠宰废水中cod、氨氮与总氮的产品，应用在此类废水处理过程中可进一步提高该类废水中cod、氨氮及总氮的处理效率，提升废水处理系统运行稳定性，保障出水指标稳定达标，具备重要应用价值与意义。

附图说明

图1为所述粪产碱杆菌gbw-hb1905在改良营养肉汤(nb)固体培养基平板上的菌落形态特征。

图2为所述粪产碱杆菌gbw-hb1905的生长曲线。

图3为所述粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂在屠宰废水中对cod浓度的影响。

图4为所述粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂在屠宰废水中对氨氮浓度的影响。

图5为所述粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂在屠宰废水中对总氮浓度的影响。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

下述实施例中所需培养基的配方如下：

1、高盐度氨态氮降解菌富集筛选液体培养基：葡萄糖5g，nh4cl1g，k2hpo41.0g，mgso4·7h2o0.1g，feso4·7h2o0.1g，nacl30g，ph7.0-8.0，蒸馏水1l。

2、高盐度硝态氮降解菌分离纯化固体培养基：葡萄糖5g，nh4cl1g，k2hpo41.0g，mgso4·7h2o0.1g，feso4·7h2o0.1g，nacl30g，琼脂粉15g，ph7.0～8.0，蒸馏水1l。

3、改良营养肉汤(nb)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，nh4cl2g/l、feso4·7h2o0.1g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、水1l、ph7.0～7.5。

4、改良营养肉汤(nb)固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，nh4cl2g/l、feso4·7h2o0.1g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、琼脂粉15g、水1l、ph7.0～7.5。

5、发酵培养基：葡萄糖30g/l、蛋白胨5g/l、酵母粉5g/l、玉米浆干粉5g/l、nacl10g/l、nh4cl2g/l、kh2po40.5g/l、feso4·7h2o0.1g/l、na2hpo42g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、余量为水，液体培养基的ph为7.0～7.5。

以上培养基在使用前，均需在121℃下灭菌20min，然后室温保存。

实施例1：粪产碱杆菌gbw-hb1905的筛选、分离与鉴定

1、粪产碱杆菌gbw-hb1905的筛选与纯化

取某市政污水厂待处理混合污水15ml，加入至135ml的pbs缓冲溶液中，振荡20min，使样品充分混匀，1000rpm离心1min，收集样品上清液，备用。取1ml上述样品上清液，加入到装有100ml高盐度氨态氮降解菌富集筛选液体培养基的锥形瓶中，28℃，180rpm恒温摇床培养2d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μl涂布于高盐度氨态氮降解菌富集筛选固体培养基上，置于28℃培养箱培养。在48h之后，挑取不同形态单菌落在改良营养肉汤(nb)固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到单菌落，将该单菌落命名为gbw-hb1905。

如图1所示，所述菌株gbw-hb1905在改良营养肉汤(nb)固体培养基平板上的菌落为圆形，乳白色，直径1-2mm，表面光滑湿润略有光泽，较扁平，中间微凸，不透明，边缘整齐，无晕环。

2、粪产碱杆菌gbw-hb1905的鉴定

以所述的菌株gbw-hb1905的dna为模板，使用16srrna通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株gbw-hb1905的16srdna测序结果与genbank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株gbw-hb1905与alcaligenesfaecalis的同源性最高，因此，确定该gbw-hb1905菌株为粪产碱杆菌。

将筛选到的菌株gbw-hb1905进行菌种保藏，所述粪产碱杆菌gbw-hb1905的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年07月15日；粪产碱杆菌alcaligenesfaecalis的保藏编号为：cgmccno.20364。

实施例2：粪产碱杆菌gbw-hb1905的生长测定及生理生化特征

1、粪产碱杆菌gbw-hb1905的生长测定

将斜面培养的粪产碱杆菌gbw-hb1905接种至改良nb培养基中，在ph为7.0-7.5，温度为28℃的恒温摇床中培养22h，制得gbw-hb1905菌液，其中每1.0h取样一次，在od600nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。如图2所示，粪产碱杆菌gbw-hb1905在培养的前4h为生长迟缓期，随后进入对数生长期，待培养至14-16h时进入对数生长末期，菌数达到6.0×10⁹cfu/ml，16-20h为生长稳定期，接着进入衰亡期，从而完成整个生长周期。

2、粪产碱杆菌gbw-hb1905的生理生化特征

将制得的gbw-hb1905菌液在nb培养基中进一步培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》中菌株生理生化检测方法对粪产碱杆菌gbw-hb1905进行检测分析。结果如表1所示。另外，粪产碱杆菌gbw-hb1905在15～40℃温度范围都能正常生长，最适生长温度为25～32℃；在ph值6～9的范围内均能生长，最适生长ph值为7.5～8.5；在溶氧含量小于0.5mg/l或大于2mg/l的范围内都能正常生长，故粪产碱杆菌gbw-hb1905属于兼性厌氧菌；此外，该菌具备产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶及分解甘油的能力，同时还可以降解动力-硝酸盐、西蒙式枸橼酸盐与半固体琼脂。另外，用于粪产碱杆菌gbw-hb1905发酵培养的适宜营养基配方如下：葡萄糖30g/l、蛋白胨5g/l、酵母粉5g/l、玉米浆干粉5g/l、nacl10g/l、nh4cl2g/l、kh2po40.5g/l、feso4·7h2o0.1g/l、na2hpo42g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、余量为水，培养基的ph为7.5～8.5。

表1粪产碱杆菌gbw-hb1905的生理生化特征

注：<+>表示阳性，<->表示阴性。

实施例3：粪产碱杆菌gbw-hb1905的盐度耐受试验

为了检验粪产碱杆菌gbw-hb1905在高盐度条件下的存活性能，对其在不同盐度条件下的生长情况进行分析检测。调整氯化钠在nb培养基中的用量配制成不同盐浓度的培养基，然后将斜面培养的粪产碱杆菌gbw-hb1905接种至不同盐浓度的nb培养基中，在ph7.0-7.5，温度为28℃的恒温摇床中培养18h，得到粪产碱杆菌gbw-hb1905的培养液，并检测该粪产碱杆菌在不同盐浓度培养基中的生长状况。结果如表2所示，gbw-hb1905具有良好的耐盐生长特性，在15～35‰的盐度范围内均能生长良好。

表2粪产碱杆菌gbw-hb1905在不同盐浓度中的生长情况

实施例4：粪产碱杆菌gbw-hb1905在某食品厂屠宰废水处理系统中的调试应用

1、粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂的制备

(1)将斜面培养的粪产碱杆菌gbw-hb1905接种至改良nb培养基中，在ph7.5-8.5，温度为28℃的恒温摇床中培养22h，得到粪产碱杆菌gbw-hb1905种子液；将粪产碱杆菌gbw-hb1905种子液按10％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.1mpa，温度28～30℃，溶氧≥25％，搅拌速度为180rpm，发酵20h，得到粪产碱杆菌gbw-hb1905发酵菌液；

(2)将粪产碱杆菌gbw-hb1905发酵菌液与载体按照体积质量比为1∶2～4的比例进行混合，并在-40～-50℃条件下真空冷冻干燥获得干燥菌粉；

(3)再向干燥菌粉中加入质量比为1∶50～100的载体，混合均匀得到所述的粪产碱杆菌菌剂；菌剂的菌含量为5.0×10⁸cfu/ml。

其中，所述载体为碳酸钙、滑石粉、硅藻土或其这几种载体的混合物。

2、将所述的粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂结合实际工程案例进行应用验证，针对潍坊市某食品厂屠宰废水的系统调试试验，该废水处理系统的基本工艺流程为：集水井+格栅+调节池+a²o+沉淀池+baf池；目前该废水处理项目已经开始运行，但处理系统一直存在出水cod、氨氮与总氮不达标的问题，出水cod浓度为90-110mg/l，氨氮浓度为10-12mg/l，总氮为18-22mg/l，均高于出水一级a的标准(一级a标准：cod≤50mg/l、氨氮≤5mg/l、总氮≤15mg/l)。

试验调试过程中采用重铬酸盐法(hj828-2017)检测废水中cod浓度、纳氏试剂分光光度法(hj-535-2009)检测废水中氨氮浓度、碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(gb-11894-89)检测废水中总氮浓度。试验调试开始前对废水处理系统中运行的各项指标进行维护检测，保障好氧段水中溶氧≥2mg/l，控制ph值在7.0-8.0之间，粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂在好氧段的添加浓度为200ppm；缺氧段水中溶氧≤0.5mg/l，并控制ph值在7.0-8.0之间，粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂在缺氧段的添加浓度为100ppm。在菌剂投加完毕后，需配合现场工艺进行24-48h的内循环调试，随后逐步恢复系统正常运行状态；在每天固定时间对沉淀池出水端的cod、氨氮及总氮浓度进行跟踪检测，整个试验调试周期为7天。整个调试周期该废水中cod、氨氮与总氮的变化结果，分别如图3、图4与图5所示，至调试进行到第5天时，系统出水cod、氨氮与总氮浓度已分别降为27mg/l、1.8mg/l和6.5mg/l，并均处于一级a标准的要求以内，随后体系中cod、氨氮与总氮浓度继续降低，并持续稳定处于出水标准要求的范围以内。表明该粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂可作为微生物菌剂开发用于去除屠宰废水中cod、氨氮与总氮的产品，应用在此类废水处理过程中可进一步提高该类废水中cod、氨氮及总氮的处理效率，提升废水处理系统运行稳定性，保障出水指标稳定达标，具备重要应用价值与意义。

本发明所述的粪产碱杆菌gbw-hb1905菌剂生产工艺成熟稳定，且在实际应用中使用方法简单方便，直接将其依据建议添加量添加至对应系统池体中即可，效果显著，具备良好的产业化前景与价值。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。