一种可以稳定保存己糖激酶（HK）的缓冲体系的制作方法

一种可以稳定保存己糖激酶(hk)的缓冲体系
技术领域
1.本产品涉及酶制剂的储存及体外诊断试剂技术领域，特别涉及利用己糖激酶作为反应底物的相关试剂盒。


背景技术：

2.己糖激酶(hexokinase)是生物体呼吸代谢过程中的关键酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用。己糖激酶存在于所有细胞中，是细胞产生能量所需要的一种酶，共有5种亚型，其中i和ii分布在线粒体外膜，与电压依赖性阳离子通道蛋白结合；这种部位让己糖激酶能直接获得线粒体产生的atp，atp是己糖激酶的底物之一。研究证明，己糖激酶在固有免疫系统中发挥模式识别受体功能，类似免疫系统的守门人角色，具有重要的功能。这种机制不仅在动物细胞存在，在人体细胞内同样存在。
3.己糖激酶可以用于多种试剂盒的配制，例如镁离子，葡萄糖等测定试剂盒，利用己糖激酶法测定血糖含量是国际上推荐的葡萄糖测定方法。酶法检测结果较为准确，可用于自动化分析仪，且酶法价格便宜，能够满足医院检验和实验室常规操作。酶法检测是通过酶促反应进行的，通过底物引起一定波长下的吸光度变化，间接计算出待测物质含量。但是，同样也存在一定问题，酶法由于其中有很多酶类参与生化反应，其稳定性是试剂成败的关键。目前市场上流通的己糖激酶保存，均做不到在保证酶活的基础上，延长储存时间，因此配制的试剂极易受到温度的影响和破坏。
4.因己糖激酶是酶制剂行业的小酶种，国内相关企业对其关注度不高。目前，国内对己糖激酶的研究主要集中在植物体代谢途径和人体肿瘤上，用于诊断的己糖激酶的制备研究还未见报道。而且工业菌种发酵酶活力相对较低，使得己糖激酶生产成本偏高随着生活水平的提高，需要做体外检测的患者数量也在急剧上升，越来越多的患者需要血糖、镁离子等试剂盒的检测，但国内诊断用己糖激酶均源自进口，需要长时间保存，酶活性也有不同程度的降低，限制了己糖激酶相关检测试剂在临床及患者自用领域的推广，因此一种可以稳定保存己糖激酶的体系，在保证酶活力的同时，也简化了以己糖激酶没底物的相关试剂盒的配制步骤，廉价的己糖激酶相关试剂盒会给相应的患者的检测带来便利。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种既可以长期稳定储存己糖激酶，同时又可以直接用于一些以己糖激酶作为反应底物试剂盒生产的缓冲缓冲体系。此体系通过在原有缓冲体系基础上添加酶保护物质，可以更好的解决相关试剂盒稳定性的问题，同时最大限度的保留了酶活力。
6.本发明是一种可以稳定保存己糖激酶(hk)的缓冲体系，其特征在于，包括储存液和稀释液；储存液是由以下含量的成分组成：
所述稀释液由以下含量的成分组成：本发明所述的一种可以稳定保存己糖激酶(hk)的缓冲体系中，缓冲液为hepes，主要起缓冲作用，使己糖激酶所处的体系ph维持相对稳定，减少环境变化对其稳定性的干扰。丙三醇、聚乙二醇、葡聚糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、bsa主要充当稳定剂的角色，保护己糖激酶活性稳定，同时在不同的体外诊断试剂中对试剂的稳定性提供保护。防腐剂为proclin300，主要抑制试剂中细菌的滋生，从而保证己糖激酶活性的稳定。
7.为了测定本发明中酶的稳定性，采用以下方法：酶活的测定：1、测定方法：分别添加1ml 0.05mol/l的tea
‑
hcl，1ml 0.555mol/l的d
‑
葡萄糖溶液，0.1ml 0.019mol/l的atp，0.2ml 0.1mol/l的mgcl2溶液，0.2ml 0.014mol/l的 nadp+，0.02ml 125u/ml的葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶到试验管和空白管。混匀后25℃水浴1min，与波长340nm处读取吸光度a1。然后试验管中加入0.05ml待测储存液，空白管加入
0.05mldh2o，于25℃继续反应5min，后速去吸光度a2。
8.酶活计算＝[(
△
a试验管
‑△
a空白管)
×
2.57
×
df]
÷
(6.22
×
0.05)。
[0009]
注：2.57：反应总体积；df：稀释倍数；6.22：β
‑
nadph在340nm的吸光系数；0.05：比色皿体积；测定设备：uv
‑
5200紫外分光光度计。
[0010]
本发明优势：1、本发明为液体状态，在后期生产使用中教固体状态相对便捷；2、本发明中的稳定物质适用范围广，对市面绝大部分以己糖激酶为底物的体外诊断试剂都适用，可以很好的保证己糖激酶的稳定；3、本发明既是一种己糖激酶储存液，又是一种可以直接用于以己糖激酶为底物的体外诊断试剂生产的原料，大大简化了配制步骤。
[0011]
表1:酶活稳定性实验结果。检测时间/月酶活/ku检测时间/月酶活/ku114.87814.31214.49914.61314.751014.39414.361114.26514.421214.31614.431813.92714.942413.80
附图说明
[0012]
图1为酶活稳定性结果。结果显示己糖激酶在本专利所述体系中保存两年酶活保存率达到92.80％。图2是相关性曲线。图3是本专利所述体系配制的葡萄糖试剂盒稳定性曲线。
具体实施方式
[0013]
以下结合具体实施例对本发明进行更详细的说明。
[0014]
实施例1利用本专利所述缓冲体系配制血清葡萄糖试剂盒，试剂盒由试剂1和试剂2组成；所述试剂1由以下成分组成：
所述试剂2由以下成分组成：所述的血清葡萄糖试剂盒试的剂1和试剂2中稀释液为本专利所述稀释液。
[0015]
所述的血清葡萄糖试剂盒的试剂2中的缓冲体系为本专利所述缓冲体系。
[0016]
所述的血清葡萄糖试剂盒的试剂比例为试剂1：试剂2＝4:1。
[0017]
所述的血清葡萄糖试剂盒加样比例为：血清样本：试剂＝1:100。
[0018]
本实施例中血清葡萄糖试剂盒在日立7180全自动生化仪上进行实验，参数如下:glu(mmol/l)＝
×
标准液浓度相关性实验实施例1中配制的血清葡萄糖试剂和市场上已注册的血清葡萄糖试剂进行比对实验，同时测定50例血清样本，结果如表2。相关性曲线如图2。
[0019]
表2相关性试验结果
通过表2和图2可以看出通过本专利所述稳定保存己糖激酶(hk)的缓冲体系配制的试剂与市场上对照试剂相关系数为0.969，相关性极强。
[0020]
稳定性实验对实施例1中配制的血清葡萄糖试剂和市场上已注册的血清葡萄糖试剂盒分成12份，其中 r1 20ml r2 5ml，2
‑
8℃保存，每个月同一天测定质控品(定标用校准品和测定的质控品为同一批号)，质控品靶值为6.11mmol/l。检测结果如表3所示。稳定性曲线如图3。
[0021]
表3稳定性实验结果
检测日期实施例1试剂结果对照试剂结果检测日期实施例1试剂结果对照试剂结果1月6.136.137月6.106.032月6.136.108月6.096.003月6.106.059月6.115.954月6.116.0610月6.055.925月6.096.0211月6.035.976月6.136.0412月6.045.90
通过表3和图3显示，通过本专利所述稳定保存己糖激酶(hk)的缓冲体系配制的试剂稳定性明显优于市场上的对照试剂。
[0022]
通过相关性试验和稳定性实验证明本专利所述稳定保存己糖激酶(hk)的缓冲体系可以用于血清葡萄糖检测试剂盒的配制且稳定性较好。