一种吸附重金属菌剂及其在土壤污染修复中的应用

1.本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体的说是涉及一种吸附重金属菌剂及其在土壤污染修复中的应用。


背景技术：

2.为促进畜禽生长并提高动物的免疫能力，畜禽饲料中往往添加超过动物自身吸收量的重金属。大量不被吸收的重金属随粪尿排除，大量的畜禽粪便未经处理堆放于农田土壤上，一旦在该土壤上种植农作物，会对农作物的生长造成破坏和损伤。超标的重金属不仅会威胁水生生物正常生长，破坏微生物群落结构，还会通过食物链富集，危害人类。其中，铜被发现用量大，影响植物细胞结构、光合作用以及植物酶的合成；锌对乳猪使用剂量可超2000mg/kg。然而，畜禽对锌的吸收低于20％。
3.现阶段对重金属的稳定化技术包括固定/稳定化技术、植物修复技术以及微生物修复技术四类。其中工程技术包括深耕翻土、换土两种措施；然而深耕等方法会破坏土壤的原始结构，造成二次污染。而光电催化降解、高级氧化降解等方式专一性差、成本高、易产生二次污染。因此，以微生物修复技术为首的生物降解法备受关注。微生物修复技术成本低、效果好，无二次污染，对土壤微环境影响小，因此应用微生物修复技术是对含有重金属污染场地的良好修复手段；但微生物对污染物的修复往往都有特异性，仅能对单一的重金属具有一定修复效果。且微生物对温度较敏感，低温环境则抑制微生物的作用。因此，本发明提供了一株耐低温微生物，在不同温度满足了对铜和锌的稳定效果，实现了该菌株的高效利用。


技术实现要素：

4.为克服现有技术不足，本发明的首要目的在于提出一种吸附重金属菌剂。
5.本发明的又一目的在于提供所述菌剂在土壤修复中的应用。
6.为实现上述目的，通过下述技术方案实现的：
7.一种吸附重金属菌剂，菌剂含经驯化的哈特草螺菌(herbaspirillumhuttiense)hhs1；所述菌株为哈特草螺菌(herbaspirillum huttiense) hhs1于2021年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no: 22975。
8.所述哈特草螺菌hhs1的驯化为在含有铜离子和锌离子的溶液中进行梯度驯化，最终获得可以耐受铜离子和锌离子的hhs1稳定化菌株。
9.所述驯化菌株活化后菌悬液与菌糠生物炭混合，再利用海藻酸钠进行包埋固定24
‑
48h，最终值得均一稳定的固定化微生物菌剂。
10.所述菌糠生物炭的质量(g)与菌悬液体积(ml)比为1：5(w:v)
‑
1:3 (w：v)；所述海藻酸钠的添加量占菌剂质量(菌剂质量为菌悬液、生物炭和海藻酸钠的质量和)的2wt％
‑
3wt％。
11.一种吸附重金属菌剂的制备方法，所述驯化菌株活化后菌液与菌糠生物炭混合，再利用海藻酸钠进行包埋固定24
‑
48h，最终值得均一稳定的固定化微生物菌剂。
12.具体为：
13.1)将所述对铜锌具有耐受和稳定化作用的草螺菌菌株hhs1置于 lb培养基中培养至对数生长期，离心收集沉淀，沉淀经无菌生理盐水重悬至od
600
为0.8～1.2的菌悬液；
14.2)将废弃菌棒于500
‑
700℃灼烧4
‑
6h后形成菌糠生物炭，待用；
15.3)将上述获得菌糠生物炭与菌悬液混合，而后搅拌条件下将菌糠生物炭与菌悬液添加至海藻酸钠溶液中，通过蠕动泵均匀地将上述混合物滴加于cacl2电解质溶液中进行包埋固定，固定化时间为24
‑
48h，弃去cacl2电解质溶液，最终制得均一稳定的固定化微生物菌剂；
16.其中，生物炭在海藻酸钠中的比例为2％
‑
5％(w:v)；菌悬液在海藻酸钠中的比例为10％
‑
20％(v:v)。
17.所述废弃菌棒为香菇种植基地的香菇生长载体。该载体的原材料主要由木屑、麦麸和石膏组成，为香菇提供了所需生长元素和生长条件。当香菇成熟后，该菌棒中的营养成分被消耗，菌棒变为废弃物堆放于环境中，将菌棒烧制成生物炭载体置于土壤环境中可实现资源利用化。现阶段还有以玉米秸秆、水稻壳等原材料烧制的生物炭材料。相较于其他生物材料，菌糠生物炭中的营养成分更高，更有利于提高土壤肥力，实现废弃物的回收利用。
18.所述步骤3)中的菌剂成分包括海藻酸钠、菌糠生物炭及菌悬液和超纯水，cacl2电解质溶液为包埋固定场所。
19.一种所述菌剂的应用，所述菌剂在吸附污染土壤中重金属中的应用。
20.所述重金属为铜和锌的稳定化。
21.一种利用所述菌剂修复污染土壤中重金属的方法，将所述菌剂加入至污染土壤中，其中菌糠生物炭与hhs1在土壤中的占质量百分比分别依次为 1％
‑
3％；5％
‑
15％。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.本发明从含有抗生素污染的原位畜禽养殖土壤中筛选分离的菌株，将该菌株驯化使其成为一株具有稳定铜离子和锌离子的菌株，该菌株对重金属铜和锌具有一定的耐受性和稳定化能力。该菌经分子鉴定为 herbaspirillum huttiense菌。该菌具有稳定铜和锌的功能，有利于丰富固定重金属的菌种资源库，为重金属污染的治理提供有效的生物降解方法。固定化微生物修复技术安全有效、环保无害且不会对环境造成二次污染。
24.利用本法获得菌株，同时以废弃的菌棒作为微生物的载体制备获得菌剂，该载体同时稳定重金属cu和zn。另外，本发明菌剂中载体处理后表面具有丰富的官能团，亲水性高，可以改善土壤持水量，改善土壤化学性质，提高土壤中酶的活性等优势。相较于普通的重金属吸附菌株，该菌株可以同时对两种重金属进行吸附和稳定化，利用生物炭和菌株的结合形成菌剂大大提高了单一菌株的吸附性能，可在短时间内迅速降低土壤中有效态重金属含量。生物炭的稳定化技术可大大降低土壤环境中的重金属有效态含量，提高重金属稳定化效率。该菌剂同时实现了重金属污染的高效稳定化及废弃物的资源利用化。由此本发明制备生物炭
‑
微生物固定化菌剂对降低土壤重金属，改善土壤基础环境具有重要意义。
附图说明
25.图1为本发明实施例提供的菌糠生物炭扫描电镜图。
26.图2为本发明实施例提供的菌糠生物炭
‑
hhs1菌剂的形态图。
27.图3为本发明实施例提供的菌糠生物炭
‑
hhs1菌剂扫描电镜图。
28.图4为本发明实施例提供的低温环境下(15℃)固定化微生物菌剂稳定土壤中铜和锌的效果图。
29.图5为本发明实施例提供的常温(25℃)环境下固定化微生物菌剂稳定土壤中铜和锌的效果图。
30.图6为本发明实施例提供的常温环境下(35℃)固定化微生物菌剂稳定土壤中铜和锌的效果图。
31.图7为本发明实施例提供的常温环境下(35℃)固定化微生物菌剂降解土壤中铜和锌的效果图。
具体实施方式
32.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
33.实施例1菌株的分离和鉴定：
34.本发明中草螺菌hhs1菌种由含有重金属
‑
抗生素污染的畜禽养殖场地土壤中筛选、驯化得到，具体步骤如下：
35.a、用土霉素筛选畜禽养殖污染土壤中的耐抗生素菌种：
36.驯化过程为：采集被畜禽养殖场产生的动物粪便堆放的污染土壤样品，在了解土壤样品中的初始土霉素浓度后，将样品在将其加入至含有土霉素的无机盐培养基中进行梯度驯化，培养基中土霉素的浓度逐步升高，依次浓度分别为50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、500μg/kg、1mg/kg、2mg/kg)，每个浓度下在15℃、150r/min于摇床中避光培养7d，定期观察培养基中菌液状态，培养基中液体由透明变浑浊，则表明菌液生长良好；
37.选择在上述梯度驯化土霉素的浓度为2mg/l下筛得的耐受土霉素的混合菌转接到含有2mg/l土霉素的固体无机盐培养基上，15℃避光培养，共转接6次；以使土霉素降解菌占据生长优势。
38.将上述获得混合菌接种到含有1mg/l土霉素的无机盐培养基中，15℃， 150r/min避光培养，于0天和3天取样过0.22μm滤膜后上lc
‑
ms测定其降解效果；经降解实验可知，3天后土霉素的去除效率可达54.20％。将所得混合菌接种至含有2mg/l的液体无机盐培养基中，培养至od
600
为1.0，经无菌生理盐水重悬，最终获得耐受且可降解土霉素的混合微生物菌悬液。
39.b、将上述驯化后获得混合微生物菌悬液用接种环分别接种于固体lb 培养基、固体无机盐培养基以及固体马铃薯培养基上进行划线培养；上述三种培养基在使用时均保证含有2mg/l的土霉素；在不同培养基下于15℃、避光培养，每隔五天对生长出来的微生物进行一次转接，重复六次，使得各培养基中菌株得以分离、纯化，最终获得单一菌株；
40.c、将分离纯化的每一单一菌株接种到含有1mg/l的土霉素抗生素为唯一碳源的无机盐培养基中进行降解实验，考察单一菌株对无机盐培养基中土霉素的降解能力，最终，选
择单一菌株中对抗生素降解效果最高的微生物hhs1。
41.所得纯化后单菌株为herbaspirillum huttiense菌，命名为hhs1，于 2021年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：cgmcc no:22975。
42.上述获得菌株经过dna提取，pcr扩增，序列测序及序列比对，菌株 hhs1的16s rdna序列与草螺菌herbaspirillum huttiense同源性达99.93％以上，亲缘关系最近，鉴定为草螺菌，简称为hhs1。
43.筛选用各培养基成分：
44.无机盐培养基(g/l)：((nh4)2so4为1、kh2po4为1、k2hpo4为1、 nacl为0.5、fecl
3 6h2o为0.05、cacl2为0.02，无水葡萄糖为10，调ph＝7.0)
45.基础培养基(g/l)：酵母粉为5，蛋白胨为10，nacl为10；培养基使用前现在121℃下高温灭菌20min。
46.马铃薯培养基：200g切块的新鲜马铃薯与加热炉上煮沸20min后，滤去土豆块后向上清液加入20g葡萄糖，定容至1l。
47.无机盐固体培养基(g/l)：((nh4)2so4为1、kh2po4为1、k2hpo4为1、nacl为0.5、fecl
3 6h2o为0.05、cacl2为0.02，无水葡萄糖为10，调ph＝7.0)，15
‑
20g琼脂粉加热煮沸。
48.lb培养基(g/l)：酵母粉为5，蛋白胨为10，nacl为10；15
‑
20g琼脂粉加热煮沸。
49.马铃薯固体培养基：200g切块的新鲜马铃薯与加热炉上煮沸20min 后，滤去土豆块后向上清液加入20g葡萄糖，定容至1l。15
‑
20g琼脂粉加热煮沸。
50.培养基使用前在115℃(含葡萄糖)/121℃(不含葡萄糖)下高温灭菌 30min。
51.16s rdna序列为：
52.tggctcagattgaacgctggcggcatgccttacacatgcaagtcgaacggcagcatagga gcttgctcctgatggcgagtggcgaacgggtgagtaatatatcggaacgtgccctagagtggg ggataactagtcgaaagactagctaataccgcatacgatctacggatgaaagtgggggatcgca agacctcatgctcctggagcggccgatatctgattagctagttggtggggtaaaagcctaccaa ggcaacgatcagtagctggtctgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggccca gactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggggcaaccctgatccagcaatg ccgcgtgagtgaagaaggccttcgggttgtaaagctcttttgtcagggaagaaacggtagtag cgaataactattactaatgacggtacctgaagaataagcaccggctaactacgtgccagcagcc gcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggt tgtgtaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaattgcatttgagactgcacggcta gagtgtgtcagaggggggtagaattccacgtgtagcagtgaaatgcgtagatatgtggaggaa taccgatggcgaaggcagccccctgggataacactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagc aaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtctactagttgtcgggtcttaat tgacttggtaacgcagctaacgcgtgaagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaa actcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacg cgaaaaaccttacctacccttgacatggatggaatcccgaagagatttgggagtgctcgaaag agaaccatcacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtc ccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctacgaaagggcactctaatgagactgccggt gacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggtagggcttcac acgtcatacaatggtacatacagagggccgccaacccgcgagggggagctaatcccagaaagt gtatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagttggaatcgctagtaatcgcg gatcagcatgtc
gcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggag cgggttttaccagaagtgggtagcctaaccgcaaggagggcgctcaccacggtaggattcgtg actggggtgaagtcgta
53.实施例2
54.将获得的hhs1菌株转移至新的液体无机盐培养基中，向无机盐培养基中加入10mg/l cu
2+
溶液和10mg/l的zn
2+
溶液作为驯化的初始浓度并在 15℃、150r/min于摇床中避光培养7d，而后逐步提高无机盐培养基中cu
2+
和zn
2+
的浓度，cu
2+
和zn
2+
浓度依次均为10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、 50mg/l，每提高一次浓度在15℃、150r/min于摇床中避光培养7d，定期观察培养基中菌液状态，培养基中液体由透明变浑浊，则表明菌液生长良好；每隔三天对驯化的hhs1进行一次转接，重复六次，每次转接时培养基内cu
2+
和zn
2+
浓度均为50mg/l，15℃、150r/min于摇床中避光培养3d；最终获得兼具cu
2+
和zn
2+
的hhs1耐受菌株；将获得的耐受重金属的hhs1菌株经离心机8000rpm离心10min，彻底与无机盐培养基分离，再经无菌生理盐水重悬，使菌悬液od
600
为1.0，保存待用。
55.实施例3
56.低温环境下(15℃)固定化微生物菌剂稳定土壤中铜的土壤修复试验：菌剂的制备：
57.1、将上述实施例2驯化后的hhs1重金属耐受菌株用液体培养基按照常规方式进行活化，活化后将菌悬液接种至lb培养基中，其含量占lb培养基的2wt％并于15℃恒温培养48h至对数期，收集培养液重悬即可得到菌液。具体为将hhs1菌株接种于lb培养基，培养至对数期后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来配置od
600
为1.0的菌悬液。
58.2、将种植蘑菇后的废弃菌棒进行烘干磨碎后置于马弗炉中，500℃灼烧4h后形成菌糠生物炭；而后将形成的菌糠生物炭经自来水洗净烘干，过 100目筛，再经高压灭菌锅于121℃，1.5mpa灭菌，收集待用，该生物炭具有多孔结构，比表面积可达105m2/g，其扫描电镜图见图1；将灭菌处理后30g菌糠生物炭加入150ml上述步骤1所得的hhs1菌悬液中，同时向 1350ml无菌水中加入30g海藻酸钠制备出海藻酸钠溶液，然后将菌糠生物炭与微生物的混合液倒入海藻酸钠溶液中，不断搅拌其混合体系，使用乳胶管利用蠕动泵将混合体系逐滴滴加至4％cacl2电解质溶液中进行包埋固定。固定化时间为24h，最终值得均一稳定的固定化微生物菌剂。此时，体系中的生物炭占菌剂质量的2％；微生物占占菌剂质量的10％；海藻酸钠占占菌剂质量的2％。制备出固定化菌剂的形态见图2。固定后的菌剂扫描电镜见图3。
59.由图2和3可见：固定化菌剂为均匀的黑色小球，表面光滑饱满；经扫描电镜可以清晰看到均匀的微生物包裹在海藻酸钠和生物炭混合体系中，菌株成均一的杆状形态，无杂菌。
60.供试土壤取自辽宁省岫岩满族自治县某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为壤沙土，ph为7.05，土壤中铜和锌有效态含量分别为124mg/kg和 242mg/kg，过1mm筛；取100g土壤向其中接种上述实施例3制备获得菌剂置于15℃恒温环境下培养一个月。重金属污染土壤修复试验设置两种处理：
61.处理1:对照处理：对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2 原始土壤(不加菌)静置30天；
62.处理2:菌剂处理(其中菌糠生物炭含量占土壤2wt％，微生物接种量占土壤10wt％)。
63.每种处理设定三次平行，分别于0天、30天取土壤样品对土壤中cu和 zn重金属有效态含量进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为20％。实验结果表明：hhs1菌株可耐受重金属铜，且对铜和锌具有良好的吸附稳定作用。重金属铜和锌有效态在施加菌剂30d后分别下降了71.4％和 59.73％。结果见图4。
64.实施例4:
65.常温环境下(25℃)固定化微生物菌剂稳定土壤中铜的土壤修复试验
66.与实施例3不同之处在于，固化制备微生物菌剂时菌株培养的温度不同，具体为：将hhs1活化后，接种于固体lb培养基置于25℃恒温培养箱培养至对数期，然后使用无菌生理盐水将菌种冲洗制成od
600
为1.0的菌悬液作为接种液。将灭菌后的菌糠生物炭与hhs1菌液与海藻酸钠溶液混合制备成菌糠生物炭
‑
草螺菌菌剂。
67.供试土壤取自辽宁省岫岩满族自治县某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为壤沙土，ph为7.05，土壤铜锌有效态含量分别为134mg/kg和284mg/kg，过1mm筛；取100g土壤向其中接种微生物菌剂置于25℃恒温环境下培养一个月。重金属污染土壤修复试验设置两种处理：
68.处理1:对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2原始土壤(不加菌)静置30天；
69.处理2:菌剂处理(其中生物炭含量占土壤2wt％，微生物接种量占土壤 10wt％)。
70.每种处理设定三次平行，分别于0天、30天取土壤样品对土壤中cu的重金属有效态含量进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为20％。实验结果表明：hhs1菌株可耐受重金属铜，且对铜具有良好的稳定作用。重金属铜有效态在施加菌剂30d后下降了55.56％和76.63％。结果见图5。
71.实施例5:
72.常温环境下(35℃)固定化微生物菌剂稳定土壤中铜的土壤修复试验
73.与实施例3不同之处在于，固化制备微生物菌剂时菌株培养的温度不同，具体为：将hhs1活化后，接种于固体lb培养基置于35℃恒温培养箱培养至对数期，然后使用无菌生理盐水将菌种冲洗制成od
600
为1.0的菌悬液作为接种液。将灭菌后的菌糠生物炭与hhs1菌液与海藻酸钠溶液混合制备成菌糠生物炭
‑
草螺菌菌剂。
74.供试土壤取自辽宁省岫岩满族自治县某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为壤沙土，ph为7.05，土壤中铜锌有效态含量分别为122mg/kg和 232mg/kg，过1mm筛；取100g土壤向其中接种微生物菌剂置于35℃恒温环境下培养一个月。重金属污染土壤修复试验设置两种处理：
75.处理1:对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2原始土壤(不加菌)静置30天；
76.处理2:菌剂处理(其中生物炭含量占土壤2wt％，微生物接种量占土壤 10wt％)。
77.每种处理设定三次平行，分别于0天、30天取土壤样品对土壤中cu和 zn的重金属有效态含量进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为20％。实验结果表明：hhs1菌株可耐受重金属铜和锌，且对铜具有良好的稳定作用。重金属铜有效态在施加菌剂30d后下降了87.33％和73.03％。结果见图 6。
78.根据实施例3
‑
5结果表明，该菌剂在不同温度下对污染土壤均有良好的铜锌吸附效果。其中，常温条件下(35℃)效果最优，低温环境下效果良好，微生物耐低温效果明显。
79.实施例6:
80.常温环境下(35℃)固定化微生物菌剂稳定土壤中铜和锌的土壤修复试验
81.与实施例3不同之处在于，固化制备微生物菌剂时生物炭及菌剂占整个菌剂体系的百分比不同，具体为：将hhs1活化后，接种于固体lb培养基置于35℃恒温培养箱培养至对数期，然后使用无菌生理盐水将菌种冲洗制成od
600
为1.0的菌悬液作为接种液。将灭菌后的菌糠生物炭与hhs1菌液与海藻酸钠溶液混合制备成菌糠生物炭
‑
草螺菌菌剂。
82.供试土壤取自辽宁省沈阳市某畜禽养殖场地的污染土壤，其质地为壤沙土，ph为7.05，土壤中铜锌有效态含量分别为122mg/kg和232mg/kg，过1mm筛；取100g土壤向其中接种微生物菌剂置于35℃恒温环境下培养一个月。重金属污染土壤修复试验设置两种处理：
83.处理1:对照处理：对照处理1原始土壤(不加菌)0天；对照处理2 原始土壤(不加菌)静置30天；
84.处理2:菌剂处理(其中生物炭含量占土壤2wt％，微生物接种量占土壤 5wt％)。
85.每种处理设定三次平行，分别于0天、30天取土壤样品对土壤中cu和 zn的重金属有效态含量进行分析。整个实验过程中保证土壤含水量为20％。实验结果表明：hhs1菌株可耐受重金属铜和锌，且对铜具有良好的稳定作用。重金属铜有效态在施加菌剂30d后下降了82.35％和71.35％。结果见图 7。结果表明，改变菌剂中的生物炭和菌悬液重金属的稳定化效果良好。
86.综上所述，本发明提供的固定化菌剂是一种微生物密度大，抗毒性强，吸附能力强，对目标抗生素耐受性强，具有良好降解效果的生物炭微生物复合菌剂。本发明筛选的游离单菌可在几小时内迅速生长至对数期，适应能力强，可迅速稳定土壤中的有效态重金属并降低土壤中土霉素含量。生物降解法毒性小，速度快，不会造成二次污染，值得推广。