一种水稻恶苗病的高效接种方法及其应用与流程

1.本发明属于植物病害技术领域，具体涉及一种水稻恶苗病的高效接种方法及其应用。


背景技术：

2.水稻恶苗病(rice bakanae disease)是水稻的主要病害，也是最早被科学报道的水稻病害之一，会造成水稻秧苗和成株的大量死亡，从而引起产量损失。据报道，严重的地块产量损失可达30％。近年来，由于病原菌抗药性产生、感病品种的推广、集中育秧的大面积应用，水稻恶苗病的发生逐年加重。在水稻种植机械化程度不断提高和人工成本提升的背景下，意味着很难像以前那样通过人工分拣和拔除的方法去掉病苗，这就使该病害成为现代水稻种植产业体系中亟待解决的难题。
3.水稻恶苗病主要是由藤仓镰刀菌(fusariumfujikuroi)侵染引起的，水稻种子萌发后，病原菌通过芽鞘、根和根冠等部位侵入并定殖在植株上，病原菌在生长过程代谢产生的赤霉素会不断刺激寄主生长，引起典型的徒长症状。被侵染的水稻秧苗由于侵染严重度的不同会在秧苗期到成熟期不断枯死，并在枯死植株表面形成大量红色至粉色的分生孢子。这些分生孢子会污染水稻种子或侵染小穗，引起种子带菌，这也是次年的主要初侵染源。在整个生育期内尤其是营养生长早期，健康的秧苗也有可能被病原菌分生孢子侵染造成再侵染。但是一般认为该病害的发生以种子带菌引起的初侵染为主，因此，水稻恶苗病被归为种传病害。
4.从发病规律可以看出，只要做好种子消毒就可以切断水稻恶苗病的侵染循环，从而有效控制其危害，因此药剂种子处理是最为可靠的手段。目前生产上防治水稻恶苗病的主流杀菌剂包括dmi类的咪鲜胺、种菌唑，mbc类的多菌灵，以及氰烯菌酯、咯菌腈等。次氯酸钠、乙蒜素等种子消毒剂对水稻恶苗病也有良好的防治效果。近年来，水稻恶苗病的抗药性问题日益突出，许多药剂的防效日益减弱，导致恶苗病不断爆发，生产上迫切需要新的药剂。
5.利用品种抗性是病害防控上另一种行之有效的策略，稻瘟病、白叶枯病抗性基因在水稻上利用非常成功，已经成为生产上主要防控手段。水稻恶苗病抗感品种的发病差异同样明显，然而由于其在水稻病害中相对弱势的地位，相关研究进展缓慢。但是，生产上迫切需要抗性基因及相关种质资源，随着近年来科研投入增加，水稻恶苗病抗性基因的相关研究不断加强和应用的潜力逐步显现。
6.药剂防效评估、新型防控药剂的开发、抗性基因的克隆及种质筛选都离不开高效的接种体系。然而，目前的恶苗病接种体系存在着较大缺陷，例如，病原菌拌种法虽然符合恶苗病发病规律，但接种效率非常低，而且不同品种间接种效率差异明显；常用的病原菌悬浮液浸种法接种效率也很低，且不稳定，操作难度大，其不同操作者的试验结果差异较大。菌丝块接种法不符合恶苗病的自然发病规律，且操作繁琐，需要大量的人工和物料成本，无法在大田的应用。这些接种体系，都无法满足针对水稻恶苗病防控药剂开发及抗性基因应
用等相关研究的需求。


技术实现要素：

7.针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种高效水稻恶苗病的接种方法。
8.本发明的另一目的在于提供该高效接种方法在水稻抗性鉴定和防控药剂评估中的应用。
9.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案加以实现：
10.一种水稻恶苗病的高效接种方法，该接种方法包括以下步骤：
11.1)水稻恶苗病菌促产孢液的配制：znso4·
7h2o 2g，h3bo
3 1g，mncl2·
4h2o0.5g，feso4·
7h2o0.5g，cocl2·
6h2o 0.1g，cuso4·
5h2o 0.1g，na2moo4·
5h2o 0.1g，na4edta 5g，生物素0.01克，维生素b10.01克，维生素b20.01克，维生素b60.01克，对氨基本胂酸0.01克，烟酸0.01克，硼酸0.01克，甲基硒代半胱氨酸0.01克，上述化合物溶于100毫升水中，即为水稻恶苗病菌促产孢液；
12.2)水稻恶苗病菌的发酵：将步骤1)配制的水稻恶苗病菌促产孢液稀释1000倍，得稀释液；将强筋小麦粒于稀释液中浸泡后捞出晾至表面微干，转入灭菌器皿中高温灭菌30-300分钟，灭菌完成后晾凉至室温，供接种备用；
13.3)发酵种子液的制备：利用5毫米打孔器打取培养在pda平板上的镰刀病原菌菌饼，接种到pdb液体培养基中培养，培养条件为：30℃的温度条件下200rpm摇培2-7天，即为发酵种子液；
14.4)病原菌孢子悬浮液制备：将步骤3)制得的发酵种子液按照体积比1:100的比例接种到步骤2)灭菌处理后的小麦粒，30℃静置培养5-10天后，将小麦粒上的镰刀菌发酵物里的孢子和菌丝用水洗下，即得病原菌孢子悬浮液；
15.5)水稻恶苗病菌接种物的制备：以蛭石为病原菌孢子悬浮液载体，按照体积比病原菌孢子悬浮液：蛭石＝1:2-1:10的比例，将蛭石加入到病原菌孢子悬浮液中，于塑料薄膜上搅拌均匀后平铺在塑料薄膜上直至蛭石阴干，或者于烘箱或培养箱中烘干，得带菌蛭石，备用；
16.6)接种方法及方法选择：采用浸种-带菌蛭石拌种-催芽-播种、浸种-催芽-带菌蛭石拌种-再催芽-播种或撒施中的任一种方式或两种方式的结合进行接种。
17.进一步地，步骤2)中，强筋小麦粒于稀释液中浸泡时间为3-15h，强筋小麦粒转入灭菌器皿中至溶容量的1/4到1/2。
18.进一步地，步骤2)中，高温灭菌温度为121℃，灭菌时间为180-300分钟。
19.进一步地，步骤3)中，镰刀病原菌的菌龄5-10天，接种密度为6个菌饼/200毫升。
20.进一步地，步骤4)中，病原菌孢子悬浮液中孢子浓度控制在107至109每毫升之间。
21.进一步地，步骤5)中，蛭石的规格采用20-60目的尺寸，烘箱或培养箱的烘干温度不超过35℃。
22.进一步地，步骤6)中，接种和播种优先方法1+方法3的组合，或者方法2+方法3的组合，浸种-带菌蛭石拌种-催芽-播种具体为：水稻种子浸种24-72小时后，沥干水分，每100克种子(以干种子计算)加入10-50毫升带菌蛭石后，充分搅拌均匀，使种子表面粘附一层均匀
的带菌蛭石，25-28℃催芽12-24h，之后播种；浸种-催芽-带菌蛭石拌种-再催芽-播种具体为：水稻种子浸种24-72小时后，25-28℃催芽至多数种子出芽至1/2谷粒长度，加入10-50毫升带菌蛭石并加入少量无菌陶粒，充分搅拌均匀后，25-28℃再次催芽12-24h，之后播种。
23.进一步地，步骤6)中，撒施是指在播种前将带菌蛭石均匀的施于育秧介质上，将常规浸种催芽后的水稻种子播种在撒施带菌蛭石的苗床或育秧盘上，也可以根据实际情况选择先播种后，再撒施蛭石。
24.进一步地，蛭石使用量与育秧方式有关，大田水旱育秧苗床每平方米施用50毫升以上，以100毫升为宜；机插秧标准大育秧盘每盘施用30毫升以上，以50毫升为宜。
25.在实际操作中可以将浸种-带菌蛭石拌种-催芽-播种或者浸种-催芽-带菌蛭石拌种-再催芽-播种同撒施结合起来，即利用带菌蛭石催芽的同时使用带菌蛭石处理育秧基质，可以提高接种效率。
26.进一步地，水稻恶苗病的高效接种方法在水稻抗性鉴定及防控药剂评估中的应用。
27.本发明接种方法具有接种效率高、操作简便的优点，并可以节省物料和人工，在室内、温室和大田实验都可以应用，适应性广。
附图说明
28.图1为实施例5不同处理下水稻恶苗病菌的孢子产量；
29.图2为实施例6蛭石对水稻恶苗病菌孢子的保护作用。
具体实施方式
30.以下结合具体实施例及说明书附图对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。
31.本发明三种接种方法，浸种-带菌蛭石拌种-催芽-播种记为本发明接种方法1；浸种-催芽-拌种-播种记为本发明接种方法2，撒施记为本发明接种方法3。
32.实施例1：水育秧模式下不同恶苗病接种方法的比较
33.水稻种子：中嘉早17，使用3％的过氧化氢处理20min；
34.试验地点：中国水稻研究所试验基地；
35.处理设置：每处理3次重复，每重复使用200克干种子，育秧苗床2.5平方米，采用随机区组排列，处理间塑料板隔开，重复间水沟分隔。
36.处理1：不接菌(空白对照)；
37.处理2：恶苗病菌液处理干种子后30℃烘干，正常浸种催芽(模拟自然种子带菌)；
38.处理3：常规接种方法(清水浸种48h，后催芽至1粒谷长，恶苗病菌液中震荡培养24h，过滤后播种)；
39.处理4：浸种后50毫升带菌蛭石拌种后催芽；(本发明接种方法1)；
40.处理5：浸种后催芽至至1/2谷粒长度，使用50毫升带菌蛭石搅拌后，继续催芽18h(本发明接种方法2)；
41.处理6：常规方式浸种和催芽，播种前将250毫升带菌蛭石均匀的撒施在苗床上，之后再播种(本发明接种方法3)；
42.处理7：按照处理4催芽然后，播种前按照处理6利用带菌蛭石处理苗床(本发明接种方法1+接种方法3)。
43.病情调查播种25天后，调查各苗床病株数和健株数，计算发病率。试验结果见表1。
44.表1水育秧模式下不同恶苗病接种方法的发病率
45.处理发病率(％)差异显著性13.36
±
0.12ee210.63
±
1.19dd316.69
±
0.56cc432.02
±
1.33bb533.22
±
2.54bb622.59
±
1.84cc747.35
±
3.84aa
46.从表1所示试验结果可以看出本发明接种方法(处理4-处理7)的发病率明显高于常规的接种方法(处理2-3)，说明本发明的接种方法更为高效。本发明的接种方法1～3的发病率在22.59～33.22％之间，完全可以达到杀菌剂药效评估和水稻品种抗性评估的要求。接种方法1和接种方法3结合使用的接种发病率达到了47.35％，明显高于其他各处理。说明方法1可以和方法3配合使用，能大幅提高接种发病率。
47.实施例2：机插秧育秧模式下不同恶苗病接种方法的比较
48.水稻种子：中早39，使用3％的过氧化氢处理20min；
49.试验地点：中国水稻研究所试验基地温室；
50.处理设置：每处理3次重复，每重复使用100克干种子，每个重复1个育秧盘。
51.处理1：不接菌(空白对照)；
52.处理2：常规接种方法(清水浸种48h，后催芽至1粒谷长，恶苗病菌液中震荡培养24h，过滤后播种)；
53.处理3：浸种后50毫升带菌蛭石拌种后催芽(本发明接种方法1)；
54.处理4：浸种后催芽至至1/2谷粒长度，使用50毫升带菌蛭石搅拌后，继续催芽18h(本发明接种方法2)；
55.处理5：常规方式浸种和催芽，播种前将40毫升带菌蛭石和种子混用，均匀的撒施育秧基质，之后再播种(本发明接种方法3)；
56.处理6：按照处理3催芽然后，播种前按照处理5利用带菌蛭石处理育秧基质(本发明接种方法1+接种方法3)；
57.处理7：按照处理4催芽然后，播种前按照处理5利用带菌蛭石处理育秧基质(本发明接种方法2+接种方法3)。
58.病情调查播种28天后，调查各盘病株数和健株数，计算发病率，试验结果见表2。
59.表2机插秧育秧模式下不同恶苗病接种方法的发病率
60.处理发病率(％)差异显著性11.76
±
0.42f f220.38
±
0.85e e336.37
±
0.99cd d
441.86
±
1.78c c533.08
±
2.15d d655.6
±
2.73a a749.95
±
2.73b b
61.从表2所示试验结果可以看出，本发明接种方法(处理3-处理7)的发病率明显高于常规的接种方法(处理2)，说明本发明的接种方法更为高效。本发明的接种方法1～3在单独使用的情况下，发病率在33.08-41.86％之间，完全可以达到杀菌剂药效评估和水稻品种抗性评估的要求。其中以催芽后带菌蛭石拌种催芽(接种方法2)发病率最高，达到了41.86％，说明本发明的接种方法非常高效。
62.接种方法1与接种方法3结合使用(处理6)和接种方法2与接种方法3结合使用(处理7)接种的发病率要明显高于其他各处理，说明带菌蛭石接种育秧基质和带菌蛭石催芽相结合可以提高接种效率。其中接种方法1与接种方法3结合使用(处理6)发病率稍高，但与处理7相比(接种方法2与接种方法3结合使用)差距不大。因此，生产上可根据实际情况灵活选择最适宜的接种方法。
63.实施例3：本发明接种方法在水稻恶苗病防控药剂防效评估中的应用
64.水稻种子：中早39；
65.试验地点：中国水稻研究所试验基地；
66.处理设置：每处理3次重复，每重复使用200克干种子，育秧苗床2.5平方米，采用随机区组排列，处理间塑料板隔开，重复间水沟分隔。试验设计如表3所示。
67.表3试验设计
68.序号药剂处理处理方式125％咪鲜胺ec 2000倍浸种225％氰烯菌酯sc 2000倍浸种324.1％肟菌酯
·
异噻菌胺20毫升/千克干种种子包衣46.25％咯菌腈
·
精甲霜灵300毫升/千克干种种子包衣
69.分别按照下列方式处理种子
70.1.不接种；
71.2.使用常规的接种方法(催芽后菌液浸种)；
72.3.浸种后催芽至至1/2谷粒长度，使用50毫升带菌蛭石搅拌后，继续催芽18h(本发明接种方法2)；
73.4.浸种后50毫升带菌蛭石拌种后催芽，播种前利用带菌蛭石处理育秧基质(本发明接种方法1+接种方法3)。
74.病情调查播种28天后，调查各苗床病株数和健株数，计算发病率，试验结果见表4。
75.表4不同接种方法下各药剂的防效
[0076][0077]
在实际生产中不可能会将病原菌人工接种，而病原菌接种只是在发病率无法保证的情况下模拟自然发病，因此一个理想的接种方法下，各药剂的表现应该和自然发病情况下一致。从表4所示试验结果可以看出，本发明的两种接种方法下各药剂的防效表现的趋势和自然发病下基本相同。而常规方式接种和自然发病有一定的差距，具体表现在利用该方式接种情况下24.1％肟菌酯
·
异噻菌胺的防效最高，与自然发病情况下的试验结果差异较大。从各防效结果的标准差来看，利用本发明的两种方法接种的情况下各处理防效的标准差明显小于自然发病和常规方式接种，说明利用本发明接种方式的药剂防效评估方式更为精确。
[0078]
因此，本发明的接种方法更符合水稻恶苗病的发病规律，利用该方法开展防控药剂防效评估试验，更为准确和精确。
[0079]
实施例4：本发明接种方法在不同品种水稻恶苗病抗性评估中的应用
[0080]
水稻种子：中早39，嘉禾218，秀水134，甬优12；
[0081]
试验地点：中国水稻研究所试验基地网室；
[0082]
处理设置：每处理3次重复，每重复使用50克干种子，利用育秧盘育秧，采用随机区组排列。
[0083]
分别按照下列方式处理种子：
[0084]
1.不接种；
[0085]
2.使用常规的接种方法(催芽后菌液浸种)；
[0086]
3.浸种后50毫升带菌蛭石拌种后催芽(本发明接种方法1)；
[0087]
4.按照处理3催芽然后，播种前利用带菌蛭石处理育秧基质(本发明接种方法1+接种方法3)；
[0088]
病情调查播种25天后，调查各秧盘病株数和健株数，计算发病率，试验结果见表5。
[0089]
表5不同接种方法下各品种水稻恶苗病发病率
[0090][0091][0092]
由于自然发病下病害的压力不足，评估抗性往往需要利用病圃或人工接种来加重病害的发生。从表5可以看出，在自然发病情况下甬优12和中浙优8号的恶苗病发病率都为0，结果显示两者对恶苗病的抗性相等。但在生产中的表现来看，甬优12对恶苗病的抗性要弱于中浙优8号，各接种的结果也能证明这一点。从结果来看，使用本发明的两种方法接种得到水稻品种恶苗病抗性结果和自然发病情况下的抗性结果几乎一致。而常规接种方法得到的抗性结果和自然发病的结果，有所出入，比如使用常规方法的结果表明嘉禾218的抗性要高于秀水134，这与自然发病的抗性结果不同。因此，本发明的接种方法在水稻恶苗病抗性评估上要优于常规接种方式，说明本发明的接种方法适用于水稻恶苗病抗性评估的相关研究。
[0093]
实施例5：恶苗病菌促产孢液对水稻恶苗病菌孢子产量的促进作用
[0094]
供试菌株：fusariumfujikuroiem-48；
[0095]
处理设计：处理1.清水浸泡小麦粒；处理2.100000倍促产孢液；处理3.10000倍促产孢液；处理4.1000倍促产孢液；
[0096]
浸泡过的小麦粒，装入组织培养瓶(约占瓶子体积的1/3)，经灭菌后，按照1:100的比例接入种子液，发酵7天后，用300ml水冲洗孢子，通过血球计数板计数，试验结果见图1所示，促产孢液可明显提高水稻恶苗病菌的孢子产量，且产孢量随着促产孢液浓度的增产而增加，说明促产孢液对水稻恶苗病菌的孢子产生具有促进作用。
[0097]
实施例6：蛭石对水稻恶苗病菌孢子的保护作用
[0098]
供试菌株：fusariumfujikuroizj-31；
[0099]
试验设计：制备孢子悬液，分别利用蛭石(roseite)、沙土(sand)和育秧基质(media)为载体，避光晾干。在28℃培养箱培养5天和10天后，检测孢子萌发率。试验结果如图2所示，以基质和沙土载体的情况下，水稻恶苗病菌孢子萌发率随着时间快速下降，到了第十天都已经不足50％。而以蛭石为载体的情况下，孢子萌发率虽然也有一定的下降，但降幅明显变低，到了第10天仍能保持60％以上的萌发率，大大高于其他两个处理。保证接种菌体的活力对接种效率非常关键。
[0100]
因此，本试验结果可以说明，相对其它载体，蛭石可以有效保障接种用水稻恶苗病菌的活性。