一种硫酸盐还原菌及其应用

1.本发明属于硫酸盐污染修复技术领域，具体涉及一种硫酸盐还原菌及其应用。


背景技术：

2.离子型稀土矿常采用硫酸盐作为浸矿剂提取稀土元素，在浸矿过程中大量的硫酸根残留在尾矿土壤中，导致土壤酸化，破坏了土壤结构，并且酸性的土壤环境会进一步导致土壤中与稀土元素伴生的重金属元素被活化，在地表径流，土壤渗流等因素的作用下发生迁移，加剧当地土壤及水体环境的污染，危害当地人民群众的生命健康。而硫酸根作为硫酸盐还原菌生长代谢所必须的电子受体，残留了大量硫酸盐的离子型稀土尾矿土壤可以为硫酸盐还原菌的生长代谢提供良好的生长环境。硫酸盐还原菌具有还原硫酸根离子的dsrb功能基因，其生长代谢过程中能够以硫酸根为电子受体将硫酸根还原为负二价硫离子，而负二价硫离子可以与众多重金属离子结合形成金属硫化物沉淀，降低尾矿土壤中重金属离子的迁移性，所以硫酸盐还原菌在重金属污染的治理中得到了广泛的应用。
3.硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,srb)是一类以有机化合物(化能异养型)或无机化合物(化能自养型)为电子供体，产生硫化物的原核微生物类群，它不是一个分类学单位，而是对具有相同功能的微生物类群的总称，在细菌域(bacteria)和古细菌域(archaea)的5个门中均有分布，因此有些文献中也将其称为srp(sulfate-reducing prokaryotes，营硫酸盐还原的原核生物)，但由于营硫酸盐还原的古菌无论从丰度上还是从种属的数量上均远少于细菌，所以习惯上仍称其为srb。
4.srb最初是由荷兰生物学家m.w.beijerinck于1895年在研究水质软化时首先发现的，随着对硫化氢的毒性和产生过程的认识，以及对金属腐蚀原因的不断剖析，srb才完全进入了主流生物学界的认识范围，因此早期对srb的研究主要集中于如何防治srb在石油生产环境中形成生物膜以及由这种生物膜所引发的生物腐蚀。但由于多数srb的生长需要厌氧环境(至少需要较低的氧化还原电位)，直到厌氧微生物培养技术以及基于分子生物学的分析手段均成熟之后，srb的研究才开始有了较大的突破(王原，2013)。自20世纪60年代起，srb以硫酸盐为底物的代谢方式引起人们的关注，90年代的很多报道总结了srb参与的各种特殊的生命过程，丰富了异养型硫酸盐还原理论，提高了人们对这类特殊生命的认识。
5.目前国内外学者分离得到的硫酸盐还原菌还原能力普遍较低，一般在《1500mg/l的硫酸根浓度下方能生长，鲜有报道具有耐高浓度硫酸盐的菌株。需要继续寻找耐性强、还原能力高的硫酸盐还原菌，以期在具有高浓度硫酸盐污染的离子型稀土尾矿区得到良好应用。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种硫酸盐还原菌及其应用，该硫酸盐还原菌可有效解决现有的硫酸盐还原菌存在的硫酸盐耐受浓度低的问题。
7.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种硫酸盐还原菌，该硫酸盐还原菌为脱硫脱硫弧菌，其命名为desulfovibrio desulfuricans strain reo-01，于2022年01月07日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号号为：cgmcc no.24267。
9.本发明还提供一种硫酸盐还原菌在耐高浓度硫酸盐物质中的应用
10.进一步地，高浓度硫酸盐物质中硫酸根的浓度≤2500mg/l。
11.进一步地，硫酸盐物质为离子型稀土尾矿、工业废水、废渣或底泥中的污染物。
12.本发明所产生的有益效果为：
13.本发明中提供的硫酸盐还原菌reo-01属于脱硫弧菌属，其对离子型稀土尾矿中残留的硫酸根具有较强的耐受能力和还原能力，在2500mg/l的[so4
2-]中，该菌株的[so4
2-]最大去除率在第8天达到41％。本发明为离子型稀土尾矿库硫酸根污染的修复提供了一种新的优良的微生物种质资源。
附图说明
[0014]
图1为desulfovibrio desulfuricans strain reo-01菌株16s rrna基因序列pcr扩增条带的凝胶电泳结果；
[0015]
图2为desulfovibrio desulfuricans strain reo-01菌株系统发育树示意图；
[0016]
图3为desulfovibrio desulfuricans strain reo-01菌株16天内对硫酸根还原能力示意图。
具体实施方式
[0017]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018]
一、菌种的筛选
[0019]
从江西省赣州市定南县锐源生物科技有限公司厂区内离子型稀土尾矿库区采集底泥样品，采用无菌50ml离心管收集，并用4℃冰浴方式运回实验室，置于4℃保存。
[0020]
底泥样品ph值为4.2，给底泥加磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline，简称pbs)处理后，取1g样品，添加50ml postgate富集培养基，培养基配方如下：
[0021]
a液配方为：k2hpo
4 0.5g，nh4cl 1.0g，na2so
4 1.0g，cacl2·
2h2o 0.1g，mgso4·
7h2o 2.0g，dl-乳酸钠2.0g，酵母提取物1.0g，蒸馏水980ml，ph为7.0；
[0022]
b液配方为：feso4·
7h2o 0.5g；抗坏血酸0.1g,蒸馏水10ml；ph为7.0；
[0023]
c液配方为：巯基乙酸钠0.1g，蒸馏水10ml。
[0024]
postgate固体培养基则在a液中添加15g琼脂糖。
[0025]
a、c液121℃灭菌20min，b液经0.2μm孔径滤膜过滤去除杂菌，然后将a、b、c液混合，接种。厌氧避光置于30℃下培养10天，待培养液由澄清变为墨汁色后，在postgate固体培养基中涂布经过稀释的变黑培养液，在避光厌氧30℃下培养10天；挑取平板中的单菌落再次接种于postgate富集体培养基中获得纯化的培养物。
[0026]
二、菌种的鉴定
[0027]
基因组dna的提取：分离纯化后得到的菌株随机挑选几株按照5.0％的比例接种到液体培养基内扩增培养(进行扩增培养使用的培养基不加显色剂硫酸亚铁)，待菌体大量繁殖后用低温高速离心机10000g下离心10min收集菌体沉淀，用细菌全基因组dna提取试剂盒(dp302-02型，tiangen)提取srb的菌体全基因组dna(具体操作步骤参考说明书)，提取出的dna通过nano drop2000测定dna的纯度及浓度。
[0028]
16s rrna基因的pcr扩增：16s rrna是细菌及其他微生物在进化过程中高度保守的遗传信息片段，被称为细菌的“分子化石”。在16s rrna分子中含有高度保守的序列区域和v4高度变化的序列区域，适用于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。提取基因组得到的dna样品利用细菌通用引物27f(5
′‑
aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3
′
)和1492r(5
′‑
ggt tac ctt gtt acg act t-3
′
)进行链式聚合酶反应(pcr)扩增。pcr扩增体系为50μl，包括25μl 5u/μltaq dna聚合酶，2μl 10μm的引物(27f和1492r)，2μl模板dna，以及21μl双蒸水。pcr反应程序如下：94℃预变性5min；循环35次：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸80s；最后72℃延伸10min，4℃保存。
[0029]
凝胶电泳：
①
琼脂糖凝胶(tiangen agarose gel)的制备：用50
×
tbe配置1.5％的琼脂糖凝胶，微波炉高火加热2min使其溶解，冷却至50～60℃时加入核酸染料倒入模板中，凝胶聚合；
②
点样：将5μl样品与1μl加样缓冲液充分混匀后，注入到样孔中；
③
电泳：电泳缓冲液为50
×
tbe，电压为120v，电泳时间为30min；
④
紫外凝胶成像：电泳完的凝胶用紫外凝胶成像仪观察，看是否成功扩增了dna。如图1所示，图谱中看到清晰且单一的扩增条带，约为1500bp左右，将pcr筛选出阳性克隆，送至北京擎科生物科技有限公司利用3730xl测序仪进行双向测序。
[0030]
测序及鉴定：选不同基因型的代表性菌株测定16s rrna基因序列，将测序所得abi格式的文件使用seqman软件进行荧光信号识别，从而转换成碱基序列，并拼接成完整的序列；运用bioedit，识别引物，将反向序列进行反向互补配对，并将所有序列去除两端引物(27f和1492r引物的两端)；获得接近全长的16s rrna序列后，挑出代表性16s rrna基因序列，上传ncbi(national center of biotechnology information，www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库，利用blastn通过genbank序列比对分析菌株间的序列同源性，初步确定其遗传分类地位。
[0031]
构建系统发育树：为了对富集群落的系统发育有所认识，将全长16s rrna序列上传ncbi进行序列比对，挑选相关的近缘序列，连同代表性序列使用muscle进行序列多重比对，通过mega软件(version 6.0)基于最大似然法(maximal likelyhood,ml)构建富集微生物的系统发育树。用自展法(bootstrap)对所构建的系统发育树进行检测，自展重复次数设定为1000次，并利用dnastar软件包中的megalign程序对其进行序列一致度分析。desulfovibriodesulfuricans strain reo-01菌株的系统发育树如图2所示。
[0032]
基于16s rrna基因序列分析，我们培养获得的硫酸盐还原菌菌株支系属于desulfuricans，它在分类上属于bacteria域、proteobacteria门、deltaproteobacteria纲、desulfovibrionales目、desulfovibrionaceae科、desulfovibrio属，ncbi的genebank登录号为ol454786.1，16s rrna基因序列为：
[0033]
aacgcgtggataatctgcccttatgatcgggataacagttggaaacggctgctaataccggatacgctcaagatgaactttttgaggaaagatggcctctgcttgcatgctatcgcgtaaggatgagtccgcgtcccattagct
tgttggcggggtaacggcccaccaaggcaacgatgggtagccgatttgagaggatgatcggccacactggaactgaaacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcgcaatgggcgaaagcctgacgcagcgacgccgcgtgagggatgaaggttttcggatcgtaaacctctgtcagaagggaagaaactacgttgtgctaatcagcagcgtactgacggtaccttcaaaggaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgtaggctgtagtgtaagtcaggggtgaaatcccacggctcaaccgtggaactgcctttgatactgcacaacttgaatccgggagagggtggcggaattccaggtgtaggagtgaaatccgtagatatctggaggaacatcagtggcgaaggcggccacctggaccggtattgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatggatgctagatgtcggggagtattcttcggtgtcgtagttaacgcgttaagcatcccgcctggggagtacggtcgcaaggctgaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctaggtttgacatccacggaaccctcccgaaaaggaggggtgcccttcggggagccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatggatagttgccagcaagtaatgttgggcactctattcagactgcccgggttaaccgggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgcctagggctacacacgtactacaatggcgcgcacaaag
[0034]
三、硫酸盐还原菌菌株对硫酸根的还原效果
[0035]
挑取上述方法筛选获得的desulfovibriodesulfuricans strain reo-01单菌落接种于50ml postgate培养基中，于30℃厌氧避光条件下富集培养3d，所得培养液于4℃，8000g下离心分离10min，收集菌体，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤三次后重悬，调节od600值为0.3，制备菌悬液。将所得菌悬液以10％投加比(体积比)接种至postgate培养基中，培养液中[so4
2-]浓度为2500mg/l，接种desulfovibriodesulfuricans strain reo-01，培养后，检测培养底物中硫酸根含量。对照组(ck组)中用等量磷酸盐缓冲液替代菌悬液投加。将上述培养液于30℃厌氧避光条件下培养16d，每隔一定时间取样检测培养液中[so4
2-]浓度，实验重复三次，用icp-oes法测定[so4
2-]。
[0036]
desulfovibriodesulfuricans strain reo-01菌株对硫酸根的降解效果如图3所示，图中纵坐标为硫酸根消耗量，具体计算方式为：用当天空白对照的硫酸根浓度值减去样品剩余硫酸根浓度值计算得到的量。desulfovibriodesulfuricans strain reo-01菌株对硫酸根的降解8d可达41％，这一结果表明desulfovibriodesulfuricans strain reo-01菌株可以高效降解硫酸根。这为离子型稀土尾矿库区硫酸根污染的修复提供了一种新的优良的微生物种质资源。