一株塔宾曲霉Sys60及其在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用的制作方法

一株塔宾曲霉sys60及其在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株塔宾曲霉sys60及其在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用。


背景技术：

2.邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters，paes)是包含邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(dehp)和邻苯二甲酸二异癸酯等30多种化合物的一类物质。paes被用作塑化剂以及其他化工产品中的添加剂，如农药、地膜、油漆中的添加剂或塑料制品中，广泛分布土壤、空气和水体。由于农用地膜、化肥施用以及工业废水的排放，使得全国各地农业土壤的paes化合物均有超标现象(含量介于0.05～20.0mg/kg之间)。作为一种典型的持久性有机污染物，paes自然降解极其缓慢，且具有环境激素效应，成为普遍的环境污染物之一，受到了环境科学，公共卫生领域，以及普通大众的广泛关注。
3.施用微生物修复土壤是一种有效且经济的土壤修复手段。目前已报道一些细菌、真菌、藻类都可以降解paes，其中以细菌为主。细菌主要来自于sphingomonas、gordonia、rhodococcus、arthrobacter、bacillus和pseudomonas等属。与细菌相比真菌则表现出更好的降解活性。
4.因此，有必要开发一株新的降解邻苯二甲酸酯类增塑剂的真菌。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一株塔宾曲霉sys60及其在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用，筛选出的塔宾曲霉sys60能高效降解邻苯二甲酸酯类增塑剂，本发明的塔宾曲霉sys60对邻苯二甲酸酯类增塑剂(dmp，dbp、dehp)具有高效降解效果，可在3天内将1000mg/l dmp，dbp、dehp降解率达到88％以上，特别是对dehp，7天降解率达98.54％。
6.在本发明的第一方面，提供了一株塔宾曲霉sys60，所述塔宾曲霉sys60的保藏编号为：cctcc no：m2022274。
7.在本发明的第二方面，提供了一种塔宾曲霉sys60发酵菌剂，所述塔宾曲霉sys60发酵菌剂包括：将所述的塔宾曲霉sys60进行发酵获得的发酵物。
8.进一步地，所述发酵物的制备方法为：
9.将菌株sys60菌饼放置在pda固体培养基上培养，获得活化的孢子悬液；
10.将所述活化的孢子悬液接种至sys60固体发酵培养基中培养，获得固体发酵物。
11.进一步地，所述sys60固体发酵培养基的配方为：粉碎的废弃木屑36份，豆粕8份，玉米芯粉6份，k2hpo
4 0.3份，kh2po
4 0.3份，feso4·
7h2o 0.01份，mgso4·
7h2o 0.02份，caco
3 0.1份，水50份。
12.进一步地，所述接种中，将孢子悬液浓度调整至1
×
108cfu/ml，后以体积质量比为
5％接种至所述sys60固体发酵培养基。
13.进一步地，所述在pda固体培养基上培养和sys60固体发酵培养基中培养的条件均包括：培养温度为25～30℃，培养时间为4～7d。
14.在本发明的第三方面，提供了所述的塔宾曲霉sys60或者所述的塔宾曲霉sys60发酵菌剂在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用。
15.进一步地，所述应用包括：将塔宾曲霉sys60活化的孢子悬液添加至含有邻苯二甲酸酯类增塑剂的土壤中。
16.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
17.1、本发明的塔宾曲霉sys60对邻苯二甲酸酯类增塑剂(dmp，dbp、dehp)具有高效降解效果，可在3天内将1000mg/l dmp，dbp、dehp降解率达到88％以上，特别是对dehp，7天降解率达98.54％。未见报道。
18.2、本发明的塔宾曲霉sys60在起始ph 6.0-11.0和20℃-32℃具有较高的降解率。最适温度为24℃，最适起始ph为9.0。更适用于常温，偏碱性邻苯二甲酸酯类增塑剂污染土壤修复。
19.3、本发明的塔宾曲霉sys60降解dehp中间产物为原儿茶酸，显示该菌降解dehp为完全矿化过程，可完全消除毒性。
20.4、本发明的塔宾曲霉sys60在dehp污染土壤修复实验中，添加10％发酵菌剂和15％发酵菌剂，土壤中dehp的降解率可达85.19％和92.17％。
21.5、本发明提供的塔宾曲霉sys60，来源于垃圾填埋厂废垃圾，容易高浓度孢子制剂，易于扩大培养，同时对邻苯二甲酸酯类增塑剂具有高效降解活性，显示出该菌在土壤污染修复中具有良好的应用前景。
22.本发明的塔宾曲霉sys60的保藏日期为2022年3月17日，保藏编号为cctcc no：m2022274。其分类命名为塔宾曲霉sys60(aspergillus tubingensis sys60)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
24.图1是sys06的系统进化树；
25.图2是sys06在pda固体培养基上培养7天后形态以及光学显微镜观察孢子和菌丝形态；
26.图3是sys06对不同邻苯二甲酸酯(dmp、dbp、dehp和didp)的降解能力；
27.图4是不同温度和不同起始ph对sys06降解dehp的影响；
28.图5是sys06降解dehp降解动力学和酯酶酶活曲线；
29.图6是sys06降解dehp中间产物鉴定；
30.图7是sys06高浓度孢子发酵菌剂对dehp污染土壤修复效果。
具体实施方式
31.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
32.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
33.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
34.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
35.本技术发明人从采集于湖北荆州某处垃圾填埋厂废垃圾中经过初筛和复筛，筛选到一株微生物，发现1株能高效降解dehp的菌株，该细菌经菌落形态、生化及its测序分析，该菌株与塔宾曲霉属(aspergillus tubingensis)多个的菌株同源性均在96％以上，结合生理生化特性，初步确定该菌株属塔宾曲霉属(aspergillus tubingensis)，并命名为塔宾曲霉sys60(aspergillus tubingensis b2660)。
36.本发明的塔宾曲霉sys60对邻苯二甲酸酯类增塑剂(dmp，dbp、dehp)具有高效降解效果，可在3天内将1000mg/l dmp，dbp、dehp降解率达到88％以上，特别是对dehp，7天降解率达98.54％。
37.下面将结合实施例及实验数据对本技术的一株塔宾曲霉sys60及其在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用进行详细说明。
38.实施案例涉及到的培养基及试剂组分：
39.msm培养基：kh2po
4 0.5g，k2hpo
4 0.5g，cacl
2 0.01g，fe2(so4)
·
3h2o 0.001g，(nh4)2so
4 1.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，蒸馏水定容至1000ml，ph 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
40.pda培养基：马铃薯200g，切成小块煮烂，用八层纱布过滤，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，加入蒸馏水定容至1l，自然ph。115℃灭菌20min。
41.gye培养基：10g葡萄糖，5g酵母提取物，0.6g kh2po4，0.5g mgso4·
7h2o，0.4g k2hpo4，0.25g cuso4·
5h2o，0.05g feso4·
7h2o，0.05g mnso4，0.001g znso4·
7h2o，1000ml蒸馏水。115℃灭菌20min。
42.sys60固体发酵培养基：粉碎的废弃木屑36份，豆粕8份，玉米芯粉6份，k2hpo
4 0.3份，kh2po
4 0.3份，feso4·
7h2o 0.01份，mgso4·
7h2o 0.02份，caco
3 0.1份，水50份。121℃灭菌20min。
43.实施例1、菌株的筛选和鉴定
44.dehp降解真菌的初筛：选取湖北荆州某处垃圾填埋厂废垃圾，放入到含有1000mg/ldehp为唯一碳源的msm固体培养基上，28℃培养10天。挑取生长的真菌至pda固体培养基上，28℃培养，反复分离纯化。
45.dehp降解真菌的复筛：将上述真菌菌饼放置在pda固体培养基上，28℃培养5天。使用无菌水冲洗孢子，血细胞计数板计数孢子数量。将孢子悬液浓度调整至1*10^8cfu/ml。将孢子液按照1％接种量接种至含有1000mg/l dehp的gye液体培养基中，28℃，150rpm培养7天。使用二氯甲烷萃取，旋蒸后甲醇溶解样品，最后使用高效液相色谱分别测定dehp的降解
率。
46.通过上述筛选，获得1株能高效降解dehp的菌株，标号为sys60即本专利菌株。its分子鉴定：使用通用引物its1和its2对sys60基因组dna进行扩增。pcr反应扩增体系为50μl：上下游引物各1μl，模板1μl，easy taq dna polymerase(5u/μl)1μl，10
×
easy taq buffer 5μl，dntp(2.5mm)4μl，ddh2o 37μl。95℃ 10min；94℃ 30s，57℃ 45s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。将pcr扩增产物连上pclone007载体，经pcr阳性克隆检测后，送至武汉擎科生物科技公司进行序列分析，测序结果如seq id no：1所示，在ncbi上进行blast在线比对，并采用mega6.0软件，构建系统进化树(见图1)。
47.如图2，菌落在平板上生长较快，生长时有白色的菌丝体，随后形成褐黑色的菌落，并产生大量的孢子。菌落反面带淡黄色。顶囊球形，分生孢子球形。
48.结合形态学分析、系统进化树，鉴定sys60为塔宾曲霉(aspergillus tubingensis)。
49.实施例2、高浓度孢子sys60发酵菌剂的制备
50.将上述真菌菌饼放置在pda固体培养基上，28℃培养5天。使用无菌水冲洗孢子，血细胞计数板计数孢子数量。将孢子悬液浓度调整至1
×
108cfu/ml。将孢子液按照5％接种量接种至1kg sys60固体发酵培养基中28℃培养7天，即得高浓度孢子sys60发酵菌剂。
51.经过血细胞计数板计数培养后，发酵菌剂中塔宾青霉sys60孢子含量达1.65
×
109cfu/g。表明本发明提供的塔宾曲霉sys60，容易高浓度孢子制剂，易于扩大培养。
52.实施例3、sys60菌株对不同邻苯二甲酸酯类增塑剂降解效果实验
53.将上述真菌菌饼放置在pda固体培养基上，28℃培养5天。使用无菌水冲洗孢子，血细胞计数板计数孢子数量。将孢子悬液浓度调整至1
×
108cfu/ml。将孢子液按照1％接种量接种至含有1000mg/l dmp、dbp、dehp和didp的gye液体培养基中，28℃，150rpm培养7天，使用二氯甲烷萃取，旋蒸后甲醇溶解样品，最后使用高效液相色谱分别测定dehp的降解率。
54.如图3所示，sys60对1000mg/l dmp、dbp、dehp和didp的降解率分别达到了95.54％，96.64％、98.54％和62.14％。
55.实施例4、不同温度和不同起始ph对sys60降解dehp的影响
56.将上述真菌菌饼放置在pda固体培养基上，28℃培养5天。使用无菌水冲洗孢子，血细胞计数板计数孢子数量。将孢子悬液浓度调整至1
×
108cfu/ml。将孢子液按照1％接种量接种至含有1000mg/l dehp的gye液体培养基中。在不同温度和起始ph条件下，28℃，150rpm培养7天后，使用二氯甲烷萃取，旋蒸后甲醇溶解样品，最后使用高效液相色谱分别测定dehp的降解率。
57.结果如图4所示，sys60降解1000mg/l dehp在起始ph 6.0-11.0和20℃-32℃具有较高的降解率(》50％)，最适降解温度为24℃，最适降解起始ph为9.0。
58.实施例5、最适降解条件下sys60对dehp降解动力学和降解中间产物鉴定实验
59.将上述真菌菌饼放置在pda固体培养基上，28℃培养5天。使用无菌水冲洗孢子，血细胞计数板计数孢子数量。将孢子悬液浓度调整至1
×
108cfu/ml。将孢子液按照1％接种量接种至含有1000mg/l dehp的gye液体培养基中，28℃，150rpm培养。每天测定培养液的dehp含量和酯酶活性。选取36h培养液使用二氯甲烷萃取，旋蒸后甲醇溶解样品，hplc-esi-qtof-ms鉴定中间产物。
60.图5所示，随着培养时间的增加，培养基中dehp含量不断下降，酯酶酶活不断增加。培养3天后sys60对1000mg/l dehp的降解率即可达到88％以上。
61.图6所示，鉴定出中间产物原儿茶酸([m-h]-为153.0193da)，可推测dehp被真菌sys60降解dehp是先将其转化为原儿茶酸进而进入三羧酸循环实现完全矿化消除毒性。
[0062]
实施例6、sys60菌剂在土壤中降解dehp效果实验
[0063]
从湖北荆州蔬菜农田收集土壤，过筛，将dehp溶解于丙酮中，用喷壶均匀喷洒在土壤表面，使土壤dehp含量为50mg/kg。每个盆栽装入3kg含dehp的土壤，实验组为：1、添加5％发酵菌剂；2、添加10％发酵菌剂；3、添加15％发酵菌剂；对照组为不加任何菌剂的空白对照。室温放置28天后(每4天翻土一次)，使用二氯甲烷萃取，旋蒸后甲醇溶解样品，最后使用高效液相色谱分别测定土壤中dehp的含量。
[0064]
图7所示，添加5％发酵菌剂，10％发酵菌剂，15％发酵菌剂，土壤中dehp的降解率依次可达70.07％、85.19％和92.17％。
[0065]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0066]
综上可知，本发明提供的一株塔宾曲霉sys60可以同时将苯甲酸转化为对羟基苯甲酸，可避免复杂的化学合成过程，为生物法合成对羟基苯甲酸提供了一条新的途径。
[0067]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0068]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0069]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。