双层猪肠道芯片和猪人工肠道系统及其制作和应用

1.本发明涉及器官仿生技术领域，具体涉及一种双层猪肠道芯片和猪人工肠道系统及其制作和应用。


背景技术：

2.肠道健康是猪生命活动的基础和高效健康养殖的前提。肠道健康的主要标志是高效的营养消化和吸收，稳定的物质代谢和能量产生，平衡的微生物区系，以及屏障功能和粘膜免疫等防御机制。猪肠道是一个复杂、动态的器官，其生理功能受到环境或饲料等因素的影响。
3.现有的猪肠道相关研究模型可分为活体动物模型和体外细胞模型两类：
4.1.活体动物模型使用猪作为实验对象，通过生产性能评价、组织形态观察、分子生物学检测、多组学联合分析等方法进行研究。该模型虽然能够直接反映猪真实生理状态，但是存在试验成本高、周期长、重现性差和动物伦理等问题。
5.2.体外细胞模型是在培养皿或transwell内进行二维细胞培养，具有操作简便、成本低廉的优点。但是该模型无法模拟猪肠道的细胞组成、三维结构以及流体和细胞外基质，所得到的试验结果往往与体内存在一定的偏差。
6.器官芯片(organ-on-a-chip)是指在微流控芯片上构建包含多种活体细胞、功能组织界面、生物流体和机械力刺激等关键因素的器官生理微系统，可实现生物体组织或器官形态结构和功能特征的体外模拟。但是，目前器官芯片技术主要针对人体，对猪的器官模拟和研究存在空白。并且器官芯片通常使用细胞系进行培养和操作，例如人结直肠腺癌细胞系caco-2，细胞系虽然易于培养、价格低廉，但是长时间多次传代可能导致其基因型和表型发生变化，进而影响实验结果；单一的细胞系培养也无法模拟肠道丰富的细胞种类和空间分布。
7.因此，目前亟需在体外建立可真实模拟猪肠道细胞组成、三维结构以及流体微环境，具有物质吸收、转运等生理功能，能在体外长期稳定培养，可操作性强的猪人工肠道模型，为猪肠道相关研究提供基于器官水平的创新研究体系。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种双层猪肠道芯片和猪人工肠道系统及其制作和应用。本发明将微流控芯片与肠道类器官技术相结合，构建一个包含猪肠道上皮所有终末分化细胞类型、具有三维肠肠道结构和上皮屏障功能、可持续动态培养的猪人工肠道系统。本发明该系统可为猪肠道相关研究提供了接近真实生理的创新体外研究平台，解决了猪肠道研究缺乏生理相关性高、可操作性强的体外模型的问题，同时解决了传统肠道类器官技术的不足，为饲料营养价值评估、肠道微生物与宿主互作、肠道疾病模型构建、药物及饲料添加剂筛选、以肠道为核心的器官间交流机制解析提供基于器官水平的创新研究体系。
9.为实现上述目的，本发明所设计一种双层猪肠道芯片，它包括上层芯片、中间的多孔膜和下层芯；所述上层芯片上布置有上层通道，所述上层通道两端的上层芯片上分别开设有上层通道进样口和上层通道出样口，所述下层芯片上布置有下层通道，所述上层通道和下层通道的中间主体部分对称重叠设置；
10.所述上层芯片上还开设两个通孔，两个通孔与下层通道两端上下对应设置，分别下层通道进样口和下层通道出样口；且多孔膜也对应开孔，分别与下层通道进样口和下层通道出样口形成一体通道。
11.进一步地，所述上层通道和下层通道结构相同，它们的形状为直型、圆形、弯曲型中任意一种(上层通道和下层通道形状结构可根据需求功能进行设计)。
12.再进一步地，所述上层通道和下层通道为弯曲型，所述上层通道和下层通道的重叠区域呈弯曲的“肠型”且它们的两端部分均分叉设置。
13.再进一步地，所述上层通道的重叠区域弯曲处外侧对称开设有两个上层电极通道，所述上层电极通道内设置有上层铂丝电极，所述上层铂丝电极一端插入上层通道侧壁内，另一端伸出上层芯片外，两个上层铂丝电极组成上层铂丝电极组；
14.所述下层通道的重叠区域弯曲处外侧对称开设有两个下层电极通道，所述下层电极通道内设置有下层铂丝电极，所述下层铂丝电极一端插入下层通道侧壁上，另一端伸出上层芯片外，两个下层铂丝电极组成下层铂丝电极组；且上层铂丝电极组和下层铂丝电极组上下交错布置。
15.再进一步地，所述上层通道的重叠区域第一个弯曲处外侧设置有上层铂丝电极组，所述下层通道的重叠区域第二个弯曲处外侧设置有下层铂丝电极组。
16.再进一步地，所述上层通道和下层通道的高度均为100～1000μm，宽度均为100～200μm，长度均为5～100mm；所述多孔膜的孔径为0.4～10μm(小孔径多孔膜在宿主微生物互作研究中可避免微生物进入下层)；
17.所述上层铂丝电极和下层铂丝电极直径均为200μm，长度均为6～10mm。
18.优选地，上层通道和下层通道的高度均为200μm，宽度均为200μm，长度均为5mm。
19.上述上层芯片和下层芯片的材料为聚二甲基硅氧烷(pdms)材质；所述多孔膜材质为聚二甲基硅氧烷(pdms)材质、聚碳酸酯(pc)材质和聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)材质中任意一种。
20.本发明还提供了一种双层猪肠道芯片的制作方法，包括以下步骤：
21.1)设计上层通道和下层通道的形状结构，利用光刻法制作上层通道和下层通道的模具，浇筑聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂的混合物，固化、脱模、切割，得到上层芯片和下层芯片，且上层芯片和下层芯片上形成上层通道和下层通道；上层芯片分别开设有上层通道进样口、上层通道出样口、下层通道进样口和下层通道出样口；
22.2)裁剪多孔膜，备用；
23.3)将上层芯片和下层芯片的粘贴面沾取有聚二甲基硅氧烷胶(聚二甲基硅氧烷胶是由pdms预聚物和固化剂在转速设定为4000～6000r/min条件下匀胶而成)；然后将剪裁好的多孔膜贴于上层芯片，再将下层芯片贴于多孔膜上，使上层芯片、多孔膜和下层芯片粘合在一起，室温干燥；最后使用针头对应下层通道进样口和下层通道出样口将多孔膜打通；
24.4)将4根铂丝电极分别经上层电极通道和下层电极通道内插入上层通道和下层通
道内100μm，在上层电极通道和下层电极通道入口处滴加紫外固化胶，将芯片用紫外灯曝光10s使胶固化，密封侧通道，制成双层猪肠道芯片，备用。
25.本发明还提供了一种上述的双层猪肠道芯片的应用，所述应用为在芯片内培养猪肠道上皮细胞系或肠道类器官，体外模拟猪肠道的细胞组成、三维结构、流体微环境和屏障功能。
26.作为优选方案，所述双层猪肠道芯片用于培养肠道类器官或猪肠道上皮细胞系时，将肠道类器官或猪肠道上皮细胞系注入双层猪肠道芯片的上层通道内培养。
27.本发明还提供了一种猪人工肠道系统，包括流体灌注装置，所述流体灌注装置通过连接管路与猪肠道芯片组件，所述猪肠道芯片组件包括权利要求所述的双层猪肠道芯片，所述双层猪肠道芯片的上层通道进样口和下层通道进样口分别与两个独立的除泡器4连接，所述上层通道出样口和下层通道出样口分别与两个离心管5单独连接。
28.进一步地，所述除泡器是将pdms预聚物与固化剂混合后倒入模具中固化，随后切割、打孔，并与载玻片键合而成，其内部形成除泡通道，所述除泡通道包括水平的连接通道，所述连接通道两端设置两个孔道，分别为连接通道的进样口和出样口；所述进样口和出样口分别与流体灌注装置流体灌注装置和双层猪肠道芯片连通；所述连接通道间设置有1个除泡腔室或间隔设置有多个除泡腔室。
29.再进一步地，所述除泡腔室呈直角梯形体，所述连接通道的高度为0.2～5mm，所述除泡腔室的高度为8～30mm，且所述除泡腔室4.4斜面的角度为30～75
°
。
30.上述除泡器由以下步骤制备而成：
31.按上述结构设计除泡器腔室结构，并利用3d打印制成除泡器模具；取pdms预聚物与固化剂以按质量比10:1混合，将其倒入模具上，使用真空泵抽气促使气泡排出，放入65℃烘箱固化；固化后脱模，使用1mm打孔器在通道两端打孔，将其与载玻片等离子处理2min后将两者键合，放入65℃烘箱2-4h。
32.上述除泡器工作原理为：
33.当除泡器内含有两个除泡腔室时；除泡腔室与连接通道间具有高度差，当培养基从进样口流入第一个除泡腔室时，其中的气泡由于浮力的作用聚集于腔室顶部，液体则经由连接通道进入第二个除泡腔室，经过再次除泡后由出样口输出；从而防止培养基内的气泡进入猪肠道芯片影响细胞生长。
34.本发明还提供了一种上述的猪人工肠道系统的应用；其特征在于：所述应用为培养猪肠道上皮细胞系或肠道类器官，体外模拟猪肠道的细胞组成、三维结构、流体微环境和屏障功能、肠道微生物-宿主互作、肠道损伤与修复、饲料营养价值评估、药物筛选与效果评价、饲料安全检测及其相关研究。
35.本发明还提供了一种上述的猪人工肠道系统的使用方法，包括以下步骤：
36.1)将ⅰ型鼠尾胶原与基质胶的混合溶液注入芯片上下层通道内，37℃孵育1h；孵育结束后，使用dmem-f12培养基清洗通道，备用；其中，所述ⅰ型鼠尾胶原浓度为100μg/ml，基质胶的浓度为2％；
37.2)将猪肠道上皮细胞悬液或肠道类器官悬液注入上层芯片的上层通道内，在培养箱内静置培养2～24h，使其贴壁生长于多孔膜上；然后将双层猪肠道芯片与除泡器和离心管连接；
38.3)将完全培养基经脱气处理后预热至37℃，然后利用流体灌注装置将培养基经除泡器除泡后进入双层猪肠道芯片进行上皮细胞或类器官的流动培养，废弃的培养基流入至离心管中，流动培养的流速为30～60μl/h，培养时间为5-14天。
39.本发明的有益效果：
40.1)本发明提供的猪肠道芯片可在体外真实模拟猪肠道上皮细胞组成、三维肠型结构和上皮屏障功能，通过动态流体灌注可实现肠道流体微环境模拟；
41.2)本发明利用体外培养的猪肠道类器官，提高了器官芯片中细胞来源的仿生性；
42.3)本发明提供的肠道芯片通过芯片上的电极集成，可连接跨上皮电阻仪，测定多孔膜上肠道上皮细胞层的跨上皮电阻，实现肠道上皮屏障功能的原位、实时监测；
43.4)本发明提供的猪人工肠道系统除泡器组件能有效避免培养基内的气泡进入猪肠道芯片损害细胞生长，并具有制作简单、成本低廉、除泡效率高等优点；
44.5)本发明提供的猪人工肠道系统可为饲料营养价值评估、肠道微生物与宿主互作等猪肠道相关研究提供接近真实生理的创新体外研究平台。
附图说明
45.图1为双层猪肠道芯片设计图；
46.图中，上层芯片1.1、上层通道1.1.1、上层通道进样口1.1.3、上层通道出样口1.1.4、下层通道进样口1.1.5、下层通道出样口1.1.6、上层电极通道1.1.2、上层铂丝电极1.1.7、多孔膜1.2、下层芯片1.3、下层通道1.3.1、下层电极通道1.3.2、下层铂丝电极1.3.3；
47.图2为双层猪肠道芯片的拆分图；
48.图3为双层芯片制作流程图；
49.图4为双层猪肠道芯片的实物图；
50.图5为猪十二指肠、空肠、回肠类器官的显微镜明场图；
51.图6为猪人工肠道系统的示意图；
52.图中，双层猪肠道芯片1、流体灌注装置2、连接管路3、除泡器4、离心管5；
53.图7为除泡器的示意图；
54.图8为除泡器的内部结构图；
55.图中，除泡腔室4.4、进样口4.2、出样口4.3、连接通道4.1；
56.图9为紧密连接蛋白zo-1染色结果图；
57.图10为细胞骨架f-actin染色结果图；
58.图中，左图为双层猪肠道芯片通道拼接图，右图为细胞骨架f-actin染色高倍图；
59.图11为细胞增殖染色结果图；
60.图中，左图为增殖的干细胞分布图，右图为hoechst细胞核染色结果；
61.图12为双层猪肠道芯片上的微生物-宿主互作效果图；
62.图中，左图为双层猪肠道芯片上细胞明场图，右图为乳酸杆菌l.frumenti在猪肠道上皮细胞上的定植结果图。
具体实施方式
63.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
64.实施例1
65.如图1～2所示的双层猪肠道芯片1，包括上层芯片1.1、中间的多孔膜1.2和下层芯片1.3；上层芯片1.1上布置有上层通道1.1.1，上层通道1.1.1两端的上层芯片1.1上分别上层通道进样口1.1.3和上层通道出样口1.1.4，
66.下层芯片1.3上布置有下层通道1.3.1，上层通道1.1.1和下层通道1.3.1为弯曲型，上层通道1.1.1和下层通道1.3.1的中间主体部分对称重叠设置；
67.上层通道1.1.1和下层通道1.3.1的重叠区域呈弯曲的“肠型”且它们的两端部分均分叉设置。
68.上层芯片1.1上还开设两个通孔，两个通孔与下层通道1.3.1两端上下对应设置，分别下层通道进样口1.1.5和下层通道出样口1.1.6；且多孔膜1.2也对应开孔，分别与下层通道进样口1.1.5和下层通道出样口1.1.6形成一体通道。
69.上层通道1.1.1的重叠区域第一个弯曲处外侧对称开设有两个上层电极通道1.1.2，上层电极通道1.1.2内设置有上层铂丝电极1.1.7，上层铂丝电极1.1.7一端插入上层通道1.1.1侧壁内，另一端伸出上层芯片1.1外，两个上层铂丝电极1.1.7组成上层铂丝电极组；
70.下层通道1.3.1的重叠区域第二个弯曲处外侧对称开设有两个下层电极通道1.3.2，下层电极通道1.3.2内设置有下层铂丝电极1.3.3，下层铂丝电极1.3.3一端插入下层通道1.3.1侧壁上，另一端伸出上层芯片1.1外，两个下层铂丝电极1.3.3组成下层铂丝电极组；且上层铂丝电极组和下层铂丝电极组上下交错布置。
71.上层通道1.1.1和下层通道1.3.1的高度均为200μm，宽度均为200μm，长度均为5mm。多孔膜1.2的孔径为0.4～10μm；上层铂丝电极1.1.7和下层铂丝电极1.3.3直径均为200μm，长度均为6～10mm。
72.上述上层芯片1.1和下层芯片1.3的材料为聚二甲基硅氧烷(pdms)材质；多孔膜1.2材质为聚二甲基硅氧烷(pdms)材质、聚碳酸酯(pc)材质和聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)材质中任意一种。pdms具有良好的透明度、弹性以及生物相容性。pdms膜可以通过光刻法自制，孔径、孔间距、膜厚度更为自由。pc膜、pet膜等成品膜可避免复杂的多孔膜1.2制作过程，使用更为简便。pc膜成本较低，但不具有透明性，在细胞培养的明场观察中效果没有透明pet膜好。
73.如图3所示的双层猪肠道芯片1的制作方法，包括以下步骤：
74.1)芯片模具制作：使用autocad软件设计双层猪肠道芯片弯曲通道图形，并打印成菲林掩膜；将硅片用乙醇清洗然后用去离子水冲洗，以除去硅片表面的污染物，最后脱水烘干冷却至室温；利用光刻技术制作芯片上下层通道模具，取负性光刻胶su-8 2050滴加在硅片上，以1500r/min转速进行甩胶。甩胶后进行前烘。前烘的作用是使光刻胶中的有机溶剂挥发，使硅片表面的光刻胶固化，增加光刻胶与硅片之间的粘附性。待第一层光刻胶烘干后重复以上步骤进行第二次甩胶，同上述步骤进行前烘。前烘结束后，硅片上覆盖掩膜，进行曝光处理。曝光结束后立即进行后烘，放置在65℃热板上加热3min，而后转移至95℃热板上进行加热20min。随后进行显影，显影至图案清晰将硅片取出，用异丙醇冲洗，用氮气吹干。
对硅片进行硅烷化处理，制成微流控芯片模具。
75.2)芯片通道层制作：以质量比10:1称取pdms预聚物及固化剂，充分搅拌均匀。将混合物倾倒在模具上，使用真空泵抽气促使气泡排出。将培养皿放置于65℃的烘箱内5h，使pdms混合物固化。完全固化后，使用手术刀沿着模具边缘将上层芯片1.1和下层芯片1.3切割下来。切割后的上层芯片1.1使用1mm打孔器在通道对应的四个端点打孔，在上层芯片1.1上分别开设有上层通道进样口1.1.3、上层通道出样口1.1.4、下层通道进样口1.1.5和下层通道出样口1.1.6；备用。
76.3)裁剪多孔膜1.2，备用；
77.4)将上层芯片1.1和下层芯片1.3的粘贴面沾取有聚二甲基硅氧烷胶(聚二甲基硅氧烷胶是由pdms预聚物和固化剂在转速设定为4000～6000r/min条件下匀胶而成)；然后将剪裁好的多孔膜1.2贴于上层芯片1.1，再将下层芯片1.3贴于多孔膜1.2上，在显微镜下对准上下层通道1.3.1粘合使上层芯片1.1、多孔膜1.2和下层芯片1.3粘合在一起，室温干燥24h；最后使用钢针针头对应下层通道进样口1.1.5和下层通道出样口1.1.6将多孔膜1.2打通；
78.5)将4根铂丝电极分别经上层电极通道1.1.2和下层电极通道1.3.2内插入上层通道1.1.1和下层通道1.3.1内100μm，在上层电极通道1.1.2和下层电极通道1.3.2入口处滴加紫外固化胶，将芯片用紫外灯曝光10s使胶固化，密封侧通道，制成双层猪肠道芯片1(图4)，备用。
79.上述方法中，光刻胶可以根据设计的掩膜类型选择正性或负性光刻胶，光刻胶型号根据所需光刻后高度深度决定。述方法中，通道打孔器的直径可根据管路直径与连接钢针外径选择，由于pdms具有弹性，可以选择比钢针外径略小的打孔器。连接钢针可选择直钢针或l型弯折钢针，
80.实施例2
81.构建培养猪小肠上皮细胞系ipec-j2的双层猪肠道芯片，包括以下步骤：
82.将ⅰ型鼠尾胶原与基质胶的混合溶液注入双层猪肠道芯片1上的下层通道1.3.1内，37℃孵育1h。孵育结束后，使用dmem培养基清洗通道，将芯片放置一旁备用。将猪小肠上皮细胞系ipec-j2用胰酶消化，离心并用pbs清洗1次，使用dmem培养基将细胞沉淀重悬至1～5
×
105个/ml，通入上层芯片1.1通道内。将芯片放置于37℃、5％co2的培养箱内静态培养2h，待细胞贴壁后连入流体灌注系统进行流动培养；ipec-j2细胞能在多孔膜上贴壁生长，最终形成单层致密肠上皮细胞层。
83.实施例3
84.构建培养猪肠道类器官的双层猪肠道芯片，包括以下步骤：
85.1.猪肠道隐窝提取及类器官培养
86.1.1猪肠道隐窝提取
87.如图4流程所示，解剖健康仔猪，截取十二指肠肠段10cm，。纵向剖开、清洗、剥离浆膜。刮除肠绒毛，剪碎至2-5mm，使用移液枪吹打清洗肠段至上清变澄清。吸出上清液，依次加入2mm edta和温和细胞解离液，放置于4℃分别孵育30min和20min。吸出上清液，加入预冷0.1％bsa，使用移液枪吹打肠段，吸上清液用70μm滤网进行过滤，重复该步骤4-5次，收集滤液，4℃以200g转速离心5min。吸出上清液，加入预冷pbs重悬沉淀后计数。
88.1.2类器官培养
89.根据计数结果按照合适比例将基质胶与dmem-f12以1:1的比例混匀后与沉淀混合，使得隐窝数量为25个/10μl，在24孔板中以每孔50μl的量进行种板。置于37℃孵育20min，待基质胶完全凝固后，每孔添加完全培养基500μl，置于培养箱中培养，培养5～9天，得到十二指肠类器官，十二指肠类器官，备用，可进行传代或冻存。
90.基于上述方法培养分别得到空肠类器官、回肠类器官、结肠类器官；如图5为十二指肠类器官、空肠类器官、回肠类器官和结肠类器官显微镜明场图。
91.2.类器官悬液制作
92.吸出孔板中的培养基，添加预冷dmem-f12并置于冰上孵育30min，使基质胶软化。使用枪头将包裹类器官的基质胶刮下，转移至离心管中，上下吹打机械性分散类器官，4℃以200g转速离心5min。吸出上清液，加入消化液与沉淀混匀后37℃水浴；加入完全培养基终止消化，混匀后以转速200g，4℃下离心5min，小心吸出上清液，加入完全培养基重悬沉淀，得到类器官悬液；其中，类器官消化液为加入10μm y27632的tryple express，类器官消化时间可为2～4min；
93.类器官完全培养基为添加10％fbs、1％青霉素-链霉素、1
×
b27、1
×
n2、1mm n-乙酰半胱氨酸、10mm hepes、10mm烟酰胺、50ng/ml重组小鼠egf、100ng/ml noggin、500ng/ml r-spondin 1、500ng/ml wnt3a、10μm sb202190、10μm y27632、500nm ly2157299、2.5μm chir99021的dmem-f12。
94.3.双层猪肠道类器官芯片构建
95.将重悬后的类器官悬液注入上述双层猪肠道芯片1的上层通道1.1.1内，构建双层猪肠道类器官芯片；在培养箱内静置培养24h后，连入流体灌注系统进行流动培养，其中，流动培养的流速为30～50μl/h，培养时间为5-14天；随培养时间增加，细胞在多孔膜上增殖、分化并逐渐覆盖整个肠型通道，形成生长致密的上皮细胞层。
96.实施例4
97.如图6～8所示的猪人工肠道系统，，包括流体灌注装置2，流体灌注装置2通过连接管路3与猪肠道芯片组件，猪肠道芯片组件包括上述双层猪肠道芯片1，双层猪肠道芯片1的上层通道进样口1.1.3和下层通道进样口1.1.5分别与两个独立的除泡器4连接，上层通道出样口1.1.4和下层通道出样口1.1.6分别与两个离心管5单独连接。
98.上述除泡器4是将pdms预聚物与固化剂混合后倒入模具中固化，随后切割、打孔，并与载玻片键合而成，其内部形成除泡通道，除泡通道包括水平的连接通道4.1，连接通道两端设置两个孔道，分别为连接通道的进样口4.2和出样口4.3；连接通道的进样口4.2和出样口4.3分别与流体灌注装置2和双层猪肠道芯片1连通；连接通道4.1间设置有1个除泡腔室4.4或间隔设置有多个除泡腔室4.4；除泡腔室4.4呈直角梯形体，连接通道的高度h2为2mm，除泡腔室4.4的高度h1+h2为10mm，且除泡腔室4.4斜面的角度α为60
°
。
99.上述除泡器4由以下步骤制备而成：
100.按上述结构设计除泡器4腔室结构，并利用3d打印制成除泡器4模具；取pdms预聚物与固化剂以按质量比10：1混合，将其倒入模具上，使用真空泵抽气促使气泡排出，放入65℃烘箱固化；固化后脱模，使用1mm打孔器在通道两端打孔，将其与载玻片等离子处理2min后将两者键合，放入65℃烘箱2-4h。
101.上述连接管路可选择硅胶软管、特氟龙(ptfe)管、聚四氟乙烯(pfa)管、聚氟乙烯(etfe)管等。
102.实施例5
103.上述猪人工肠道系统的使用方法，包括以下步骤：
104.1)将ⅰ型鼠尾胶原与基质胶的混合溶液注入芯片上下层通道1.3.1内，37℃孵育1h；孵育结束后，使用dmem-f12培养基清洗通道，备用；其中，所述ⅰ型鼠尾胶原浓度为100μg/ml，基质胶的浓度为2％；
105.2)将猪肠道上皮细胞悬液或肠道类器官悬液注入上层芯片1.1的上层通道1.1.1内，在培养箱内静置培养2～24h，使其贴壁生长于多孔膜1.2上；然后将双层猪肠道芯片1与除泡器4和离心管5连接；
106.3)将完全培养基经脱气处理后预热至37℃，然后利用流体灌注装置将培养基经除泡器4除泡后进入双层猪肠道芯片1进行上皮细胞或类器官的流动培养，废弃的培养基流入至离心管5中，流动培养的流速为30～60μl/h，培养时间为5-14天。随培养时间增加，细胞在多孔膜上增殖、分化并逐渐覆盖整个肠型通道，形成生长致密的上皮细胞层。
107.实施例6
108.基于上述双层猪肠道芯片1的三维结构构建和上皮屏障功能检测
109.紧密连接蛋白zo-1染色：用pbs清洗通道，向上下层通道1.3.1内注入4％多聚甲醛，固定15min，pbs清洗；封闭液封闭，室温孵育90min。zo-1蛋白抗体染色，4℃孵育过夜，pbst清洗；二抗染色，室温孵育1h，通入pbst清洗；dapi染色，室温孵育10min，pbst清洗；染色完成后使用荧光显微镜观察。
110.如图9所示，红色荧光分布于细胞间，说明具有明显的紧密连接蛋白表达。
111.细胞骨架f-actin染色：用pbs清洗通道，向上下层通道1.3.1内注入4％多聚甲醛，固定15min，pbs清洗；0.1％triton x-100透化处理3-5min，pbs清洗，向上下层通道1.3.1内注入(浓度)fitc标记的鬼笔环肽溶液，室温避光孵育2h，pbs清洗；向上下层通道1.3.1内注入dapi溶液，室温孵育10min，pbs清洗；染色完成后使用荧光显微镜观察。
112.如图10所示，上皮细胞沿芯片通道生长形成肠型结构，细胞间相互连接形成单层上皮细胞层。
113.细胞增殖检测：配制edu工作液，预热的工作液与培养基1：1加入芯片通道中，孵育6h。通入pbs清洗，4％多聚甲醛固定，室温孵育15-30min，pbs清洗。使用0.1％triton x-100透化3-5min，pbs清洗。通入荧光探针反应液，室温避光孵育30min，pbs清洗。hoechst 33342染色，室温孵育10min，流动通入pbs清洗。
114.在显微镜下观察增殖细胞的分布结果如图11所示，hoechst染色显示细胞铺满双层猪肠道芯片，干细胞分布于分化细胞间。
115.实施例7
116.肠道微生物-宿主细胞互作的应用，具体步骤如下：
117.按照实施例3的步骤构建双层猪肠道类器官芯片，随后将注射器内培养基更换为无抗生素培养基，流动培养1天。同时将乳酸杆菌l.frumenti加入含0.5mm fitc-d-lys的培养基中，孵育22h，以4500r/min离心10min，使用pbs清洗3次后，使用无抗生素培养基重悬至细菌密度为1.0
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107cfu/ml备用。将乳酸杆菌悬液通入上层芯片1.1通道内，然后将芯片放
入37℃培养箱中静置2h，之后使用无抗生素培养基冲洗通道3次；将芯片连入猪人工肠道系统，以30μl/h的流速流动培养1天。互作结束后，将肠道芯片置于倒置荧光显微镜下观察乳酸杆菌l.frumenti在猪肠道上皮细胞上的黏附和定植情况。
118.如图12所示，点状绿色荧光分布于上皮细胞表面，表明乳酸杆菌l.frumenti在猪肠道上皮层上具有良好的定植效果。
119.其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。