用于检测霍乱弧菌或最小弧菌的引物和探针以及使用它们的检测方法

专利名称:用于检测霍乱弧菌或最小弧菌的引物和探针以及使用它们的检测方法
技术领域：
本发明涉及在食品检验、流行病学环境检验、和临床检查中用于检测、鉴定并计算霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和最小弧菌(Vibrio mimicus)的方法。
背景技术：
霍乱弧菌在口腔感染后产生霍乱毒素并诱导剧烈的腹泻和呕吐。在某些情况下，感染性致病菌可导致感染患者死于极度脱水。人们认为对人类有毒的霍乱弧菌仅是O1霍乱，通过使用抗-O1抗体可使之凝集。人们还将不同于细菌的弧菌分为NAG(O1-不可凝集的)-弧菌其对人类无毒。然而，1995年在印度孟加拉地区，分离出了一种没有O1抗原的新型霍乱弧菌，它引起的症状与由传统霍乱引起的症状相似，揭示出该新的霍乱弧菌菌株具有被称作O139的新O-抗原。该菌株被称作孟加拉菌株且已被揭示出具有与传统O1霍乱相似的产生霍乱毒素的基因，其产生毒素并诱导霍乱。因此，已经表明除O1霍乱外的弧菌可使人类感染并引起霍乱。事实上，除了O1和O139菌株外，还存在具有霍乱毒素基因的霍乱弧菌菌株。这类菌株可在人类中诱导霍乱。然而，除O1和O139菌株外的霍乱弧菌菌株所致的症状作为感染性疾病还没有进行过药物治疗。
在此期间，在霍乱弧菌非-O1菌株中已经很少检测出非-糖分解菌株。Davis等人已经检测了所述菌株与霍乱弧菌的DNA同源性，由此显示所述菌株稍稍不同于霍乱弧菌并将所述菌株命名为最小弧菌。已经报道过最小弧菌是一种与霍乱弧菌密切相关的菌株。特别是，除了糖分解能力(霍乱弧菌是阳性的，最小弧菌是阴性的)外，两个种类的生化性质非常相似(J.Clin.Microbiol.14，631-639，1981)(非专利文献1)。已知在最小弧菌中，有些菌株所具有的霍乱毒素基因与霍乱弧菌的相似(Microbiol Immunol 1998，42，823-828)(非专利文献2)。最小弧菌可因此诱导与霍乱相似的症状。
此外，在没有霍乱毒素基因的霍乱弧菌中，已被报道存在的菌株是具有热稳定性直接溶血素(tdh)基因的菌株(Appl Environ Microbiol52，1218-20，1986)(非专利文献3)，它是副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的致病因子；和产生大肠杆菌热稳定性肠毒素的菌株(J.Clin.Invest.85697-705，1990)(非专利文献4)。它们可引起腹泻等。同样，在最小弧菌中，已经报道过存在具有tdh基因的菌株(FEMSMicrobiol 59319-23，1990)(非专利文献5)，它可引起腹泻等，甚至在它不产生任何霍乱毒素时也是如此。
如上所述，对检测到具有O1或O139(孟加拉)血清型并产生霍乱毒素的霍乱弧菌的情况，按照“Law Concerning Prevention ofInfection of Infectious Diseases and Patients with Infectious Diseases”中详细说明的情况进行测定。此外，在除O1霍乱和孟加拉霍乱外的霍乱弧菌中，也存在产生霍乱毒素的菌株，它诱导与霍乱相似的症状。此外，不产生霍乱毒素的菌株不会引起霍乱。然而，这并不意味着它们是非致病性的。这类菌株通过产生除霍乱毒素外的毒素而诱导急性胃肠炎、腹泻等。因此，需要快速并准确地检测霍乱弧菌细菌类群。
此外，就最小弧菌而言，存在产生霍乱毒素、引起霍乱的菌株和通过产生除霍乱毒素外的毒素而引起急性胃肠炎、腹泻等的菌株。因此，还需要快速并准确地检测最小弧菌细菌类群。
使用生化技术的常规检测方法需要熟练的技术和大量的努力和时间。为了弥补这种不足，已经尝试使用基因的准确、快速且便利的方法来检测或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌。
用于检测编码引起霍乱的霍乱毒素基因的引物是已知的(J.Biol.Chem.1983，258，13722-13726)(非专利文献6)。然而，不能通过使用这种引物检测霍乱弧菌和最小弧菌，因为它们没有任何霍乱毒素基因，但产生其它毒素。
在此期间，比较霍乱弧菌和最小弧菌的16S rRNA基因的全长核苷酸序列时，在1,456个核苷酸中仅有6个是不同的(Int.J.Syst.Bacteriol.44，416-426，1994)(非专利文献7)。故而不能很清楚地将两者区别开来。因此，有报道通过比较霍乱弧菌和最小弧菌的16S-23S rRNA基因间隔区，其表明能由此将它们进行分类并制备出了仅能检测霍乱弧菌的引物(Appl.Environ.Microbiol.65，2202-2208，1999)(非专利文献8)。然而，还是存在使用引物时，错误地检测到了最小弧菌的报道(Appl.Environ.Microbiol.67，2360-2364 2001)(非专利文献9)。
发明概述如上所述，还不能通过现有的基因检测方法以高度准确性检测霍乱弧菌和最小弧菌。
在常规基因筛选方法中，普遍都忽略了细菌“种类”是含有遗传多样性的群体的事实。被推断为细菌群体成员的单一细菌菌株的核苷酸序列用作这类群体的共有序列或代表这类群体的序列，在基因的分子进化特征方面是非常危险的，因为它快速积累中性突变。具体而言，这种使用可引起错误鉴定，从而使得所检测的细菌菌株不能被检测，这是因为由于引物区的少量突变使得扩增被抑制。且由于引物特异性不足够高，可能检测出本来不想检测的某些密切相关菌株。因此，需要制备用于检测、鉴定或量化霍乱弧菌和最小弧菌的高性能且特异性的基因扩增引物以及用于特异性检测、鉴定或量化霍乱弧菌和最小弧菌的基因扩增引物，它们具有已经证实了的特异性背景、较低的错误鉴定可能性、和实际应用中足够的扩增效率和扩增特异性。
为了建立特异性检测细菌系统发育类群的基因的方法，需要尽可能多地从被检测的生物类群和与这些类群系统发育接近的生物类群中收集核苷酸序列。此外，特异性检测所针对的基因应具有足够独特的核苷酸序列，这样才能将其与最密切相关的生物区别开来。为了满足这些条件，靶基因必须具有足够快速的进化速度。此外，在高频水平传递基因(例如，副溶血弧菌的毒素基因)的情况下，不能使用独立于系统发育系外存在的基因。在本发明中被用作靶的、由gyrB基因和rpoD基因编码的蛋白对于存活是必需的。由于这个原因，这些基因几乎不会水平传递并具有适宜的进化速率，因此它们优选用于细菌系统发育分析(Int.J.Syst.Bacteriol.1998，48，813-819；Int.J.Syst.Bacteriol.1999，49，87-95)。我们已经研究出了一种测定核苷酸序列的便利的方法，包括将gyrB基因和rpoD基因用于PCR直接测序方法(日本专利公开号(Kokai)No.07-213229A(1995)和08-256798A(1996))。此外，我们已经分离出了大量霍乱弧菌。在此期间，关于最小弧菌及通过以16SrRNA序列为基础分析而报道与该细菌密切相关的那些—鳗弧菌(Listonella anguillarum)、奥氏弧菌(V.ordalii)、双氮氧弧菌(V.diazotrophicus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、纳瓦拉弧菌(V.navarrensis)、梅氏弧菌(V.metschnikovii)和辛辛那提弧菌(V.cincinnatiensis)的已知亲株(stock strain)(International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 51，1449-1456(2001))，我们已经分析了表1所列细菌菌株的gyrB和rpoD基因的部分核苷酸序列并以这种序列为基础进行了分子系统发育分析，由此揭示了系统发育关系。
表1 所用菌株




具体而言，在试验菌株通过添加了2％NaCl的脑心融合培养基的富集培养后，使用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra SYSTEMS)提取染色体DNA。使用提取出的DNA作为模板，使用gyrB通用扩增引物UP-1E和AprU，通过PCR扩增长度约为900bp的gyrB基因片段(与大肠杆菌菌株K-12的核苷酸序列第331-1212位或氨基酸序列第111-404位相对应的区)。此外，同样，使用rpoD通用扩增引物70F-M13和70R-M13，通过PCR扩增长度约为800bp的rpoD基因片段(与大肠杆菌菌株K-12的核苷酸序列第334-1125位及氨基酸序列第112-375位相对应的区)。所得PCR产物经过1％琼脂凝胶电泳，然后用溴化乙锭染色。在UV辐射下证实扩增产物的存在，然后使用Wizard PCRPreps DNA纯化系统(Promega)纯化，由此制备用于序列反应的模板。循环序列反应是使用先前加入到通用引物中的引物M13R和M13-21序列和ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(PE Applied Biosystems)进行的。使用ABI PRISM 310Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems)分析核苷酸序列。在使用测定的核苷酸序列进行分子系统发育分析，从而更准确了解了霍乱弧菌和最小弧菌的密切相关种类之后，连接gyrB和rpoD基因的部分序列，然后进行分析。所得核苷酸序列用Clustal W计算机程序经过多次序列对比分析。随后，通过使用PHYLIP计算机程序包，通过以遗传距离为基础的邻接方法制备分子系统发育树，其中遗传距离是使用Kimura′s 2-参数模型计算的。结果显示霍乱弧菌和最小弧菌属于不同于弧菌属其它细菌单一系统发育系。具体而言，霍乱弧菌和最小弧菌各自形成独立的单一系统发育类群(
图1)。因此，为了建立可仅检测霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群的遗传筛选方法，首先找出了密切相关种类核苷酸序列的差异。即，鉴定在霍乱弧菌和最小弧菌类群内保守但与弧菌属其它细菌不同的核苷酸位点。具体而言，找出霍乱弧菌和最小弧菌所属系统发育类群的共有序列并与基于分子系统发育分析结果确定与该系统发育系密切相关的、图1所示C1-C3聚簇的共有序列进行比较。因此，制备系统发育特异性信息图(图2和3)。下列位点对霍乱弧菌和最小弧菌所属的系统发育系是特异的如图2所示，就gyrB基因而言，序列表中SEQ ID NO1的第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、和885位(此后也称作核苷酸数)；以及如图3所示，就rpoD基因而言，序列表中SEQ ID NO2的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、和789位。使用对含有这些特征核苷酸的系统发育系特异的序列可设计出具有高度特异性的探针和具有高度特异性和极佳扩增效率的基因扩增引物。例如，可设计含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15个或以上连续核苷酸(其含有不同于密切相关种类的核苷酸，从而总含有不同于密切相关种类的核苷酸位点)的引物，优选含有20个或以上核苷酸，且进一步优选含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20个以上、40个以下的连续核苷酸。同样，还可设计含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15个或以上连续核苷酸(其含有不同于密切相关种类的核苷酸，从而总是含有不同于密切相关种类的核苷酸位点)的探针，优选含有20个或以上核苷酸，且进一步优选含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20个以上、100个以下的连续核苷酸。此外，为了制备引物和探针，可优选使用高频含有上述不同核苷酸的区(含有2个或以上这样的核苷酸)，如就gyrB基因而言，含第96和107位的区，含第258、270、279、或285位中任意2个或多个位点的区域；含第543、552、或557位中任意2个或多个位点的区域；含第690、702、或714位中任意2个或多个位点的区域；和含第729、733、或734位中任意2个或多个位点的区域；含第759和771位的区；含第782、786、792、或795位中任意2个或多个位点的区域；就rpoD基因而言，含第66、67、75、或90位中任意2个或多个位点的区域；含第177、178、180、或186位中任意2个或多个位点的区域；含第223、227、228、或231位中任意2个或多个位点的区域；含第250、251、255、257、259、或264位中任意2个或多个位点的区域；含第300、301、302、303、305、313、或314位中任意2个或多个位点的区域；含第362、369、373、374、或380位中任意2个或多个位点的区域；含第400、402、409、410、415、或416位中任意2个或多个位点的区域；含第423、427、433、444、或447位中任意2个或多个位点的区域；含第504、510、或513位中任意2个或多个位点的区域；含第543、556、或558位中任意2个或多个位点的区域；及含第747、757、762、或763位中任意2个或多个位点的区域。此外，就引物而言，3’-末端优选是对霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群特异的核苷酸。本发明包括使用这些引物和探针以及其它试剂用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌的试剂盒。
在此期间，霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群，即，霍乱弧菌细菌类群和最小弧菌细菌类群，进一步形成独立的单一系统发育类群(图1)。因此，为了建立可分开检测霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群的遗传筛选方法，以和上述相似的方式鉴定了在各霍乱弧菌和最小弧菌类群内保守的区，以及它们之中彼此不同的核苷酸位点。具体而言，将霍乱弧菌和最小弧菌所属的系统发育类群的共有序列彼此进行比较，从而制备系统发育-特异性信息图(图4、5、6、和7)。关于霍乱弧菌所属的单一系统发育类群，下列位点是特异的如图4所示，就gyrB基因而言，序列表中SEQ ID NO3的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、和885位；如图5所示，就rpoD基因而言，序列表中SEQ ID NO4的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、和804位。关于最小弧菌所属的系统发育类群，下列位点是特异的如图6所示，就gyrB基因而言，序列表中SEQ ID NO5的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、和885位；如图7所示，就rpoD基因而言，序列表中SEQID NO6的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、和804位。使用对霍乱弧菌或最小弧菌所属的系统发育类群特异并含有这些特征核苷酸的序列可设计出具有高度特异性的探针和具有高度特异性和极佳扩增效率的基因扩增引物。例如，可设计含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15个或以上连续核苷酸(含有区别两个细菌种类的核苷酸，从而总是含有区别霍乱弧菌和最小弧菌的核苷酸位点)的引物，优选含有20个或以上核苷酸，且进一步优选含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20个以上、40个以下的连续核苷酸。同样，还可设计含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15个或以上连续核苷酸(其含有区别两个细菌种类的核苷酸，从而总是含有区别霍乱弧菌和最小弧菌的核苷酸位点)的探针，优选含有20个或以上核苷酸，且进一步优选含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20个以上、100个以下的连续核苷酸。此外，为了制备引物和探针，可优选使用高频含有上述不同核苷酸的区(含有2个或以上这样的核苷酸)，如就gyrB基因而言，含第36、39、42、45、48、或51位中任意2个或多个位点的区域；含第285、291、或306位中任意2个或多个位点的区域；含第384、390、或399位中任意2个或多个位点的区域；和含第867、873、879、882、或885位中任意2个或多个位点的区域；就rpoD基因而言，含第93、96、105、114、115、116、或117位中任意2个或多个位点的区域；含第126、132、或141位中任意2个或多个位点的区域；含第216、222、231、或240位中任意2个或多个位点的区域；含第252、254、255、260、261、或264位中任意2个或多个位点的区域；含第276、285、或291位中任意2个或多个位点的区域；含第327、333、342、或345位中任意2个或多个位点的区域；含第424、426、432、441、445、或446位中任意2个或多个位点的区域；含第448、450、453、或468位中任意2个或多个位点的区域；含第489、495、或501位中任意2个或多个位点的区域；含第519、522、525、或540位中任意2个或多个位点的区域；含第585、591、600、603、或606位中任意2个或多个位点的区域；含第639、645、654、或657位中任意2个或多个位点的区域；含第666、675、679、680、681、或687位中任意2个或多个位点的区域；含第702、705、708、714、720、或723位中任意2个或多个位点的区域；及含第729、732、741、或750位中任意2个或多个位点的区域。此外，就引物而言，3’-末端优选是对霍乱弧菌或最小弧菌特异的核苷酸。
具体而言，用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群的引物如下(1)就gyrB基因而言，这种基因扩增引物的例子包括包含SEQ IDNO1第96和107位核苷酸的SEQ ID NO1中15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO1第258、270、279、或285位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO1第543、552、或557位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO1第690、702、或714位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ IDNO1第729、733、或734位任何位核苷酸的SEQ ID NO1中15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO1第759和771位上含两个或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；和包含SEQ ID NO1第782、786、792、或795位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物。更具体的例子包括下列基因扩增引物，它是5’-tycaywcscaaacttacca-3’或与其互补的链、5’-gaaytctggcgtgtcgatcaag-3’或与其互补的链、5’-catrtagttgttcaaagtacgg-3’或与其互补的链、5’-ggatttyacytccgaagaaacyagc-3’或与其互补的链、5’-ygccagcttctcattcatr-3’或与其互补的链、5’-cgcttcgcttgggttttcc-3’或与其互补的链、或5’-caataatcttcgaacaaacgt-3’或与其互补的链、以及所含链或其互补链包含上述序列的基因扩增引物中的任何一个。
(2)就rpoD基因而言，这种基因扩增引物的例子包括包含SEQ IDNO2的第66、67、75、或90位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第177、178、180、或186位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第223、227、228、或231位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第250、251、255、257、259、或264位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第300、301、302、303、305、313、或314位中的两个或以上核苷酸的SEQ IDNO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第362、369、373、374、或380位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第400、402、409、410、415、或416位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第423、427、433、444、或447位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ IDNO2的第504、510、或513位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO2的第543、556、或558位中的两个或以上核苷酸的SEQ IDNO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；及包含SEQ ID NO2的第747、757、762、或763位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物。更具体的例子包括下列基因扩增引物，它是5’-gattgctgagtatcctggaaccatc-3’或与其互补的链、5’-gaycctaacgacatggaaacc-3’或与其互补的链、5’-ttcwgarctytctgaagcs-3’或与其互补的链、5’-agatgaygmkgtcgysgar-3’或与其互补的链、5’-cgacggtgaaagyagcgacag-3’或与其互补的链、5’-caatgaactgcgcggyaagtt-3’或与其互补的链、5’-gtcacgaccaaattcattaac-3’或与其互补的链、5’-gyytgamgcttcagawgcttgrtka-3’或与其互补的链、5’-ygargtrcgcagagtttcaacc-3’或与其互补的链、5’-catyaccaarcgytcttgg-3’或与其互补的链、或5’-cgytcaacagacagtgawgtc-3’或与其互补的链、以及所含链或其互补链包含上述序列的基因扩增引物的任何一个。
霍乱弧菌的引物如下(1)就gyrB而言，这种基因扩增引物的例子包括包含SEQ IDNO3的第36、39、42、45、48、或51位中的两个或以上核苷酸的SEQID NO3中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO3的第285、291、或306位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO3中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO3的第384、390、或399位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO3中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO3的第867、873、879、882、或885位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO3中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物。更具体的例子包括含5’-ggtggttaacgcgctytct-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-ycgatgaacgtgaagaagataaa-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-tgagaaagtcttccacttt-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gttaaagtggaagactttc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gggtaagccwgcaagatcc-3’或与其互补的链的基因扩增引物以及所含链或其互补链含有上述序列的基因扩增引物。
(2)就rpoD而言，这种基因扩增引物的例子包括包含SEQ IDNO4的第93、96、105、114、115、116、或117位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第126、132、或141位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第216、222、231、或240位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第252、254、255、260、261、或264位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ IDNO4的第276、285、或291位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第327、333、342、或345位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第424、426、432、441、445、或446位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第448、450、453、或468位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第489、495、或501位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第519、522、525、或540位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第585、591、600、603、或606位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第639、645、654、或657位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第679、680、681、687、或702位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO4的第705、708、714、720、或723位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；及包含SEQ ID NO4的第729、732、741、或750位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物。更具体的例子包括含5’-attcttgagcagtttgatcgt-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-caggccgaagagctacgtctc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-tgagctttctgaagcggatctcgcg-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gaagatgatgctgtcgtcgaa-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gaagatgaagacgaagat-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-cggtatcgaccctgaactg-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-catcaagcttctgaagcgtcaga-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-tcaaccaagtggtcgaattgc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-acggaagatatccarcactaa-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gcgaacacgatccattgaagtg-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gatgaacgatttcttcggcatc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-aaggactttatccagccac-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-ttcttcttgctcacggactttcgc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-ttctgaattgaacggcggatc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-tgtctcttgctcgatcatttgt-3’或与其互补的链的基因扩增引物、以及所含链或其互补链含有上述序列的基因扩增引物。
最小弧菌的引物如下(1)就gyrB而言，这种基因扩增引物的例子包括包含SEQ IDNO5的第36、39、42、45、48、或51位中的两个或以上核苷酸的SEQID NO5中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO5的第285、291、或306位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO5中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO5的第384、390、或399位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO5中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO5的第867、873、879、882、或885位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO5中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物。更具体的例子包括含5’-ggtagtgaatgccctgtca-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-cggatgagcgtgaagaagataag-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-tgaaaaagtattccacttc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gttgaagtggaatactttt-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-wggcaaaccagckarrtct-3’或与其互补的链的基因扩增引物、以及所含链或其互补链含有上述序列的基因扩增引物。
(2)就rpoD而言，这种基因扩增引物的例子包括包含SEQ IDNO6的第93、96、105、114、115、116、或117位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第126、132、或141位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第216、222、231、或240位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第252、254、255、260、261、或264位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ IDNO6的第276、285、或291位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第327、333、342、或345位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第424、426、432、441、445、或446位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第448、450、453、或468位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第489、495、或501位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第519、522、525、或540位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第585、591、600、603、或606位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第639、645、654、或657位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第679、680、681、687、或702位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；包含SEQ ID NO6的第705、708、714、720、或723位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物；及包含SEQ ID NO6的第729、732、741、或750位中的两个或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15个或以上连续核苷酸的链或其互补链的基因扩增引物。更具体的例子包括含5’-cattcttgaacagtttgacaag-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-caggcagaagaactacgtctg-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-agarctctctgaagccgatctcgct-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gaagatgacgaggtcgcggag-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gaggatgaagatgaagac-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gggtattgaccctgagctc-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-taaccaagcatctgaagcttcaag-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-tcaaccaaatggtcaaattgt-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gcggaaratatccagtaccag-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-acgaacacgatccatcgaggta-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-aataaatgatttctttggcatt-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gagyactttatcragccat-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-gtcttcttgctcacgtactttttg-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-ttggattgaagggcgaata-3’或与其互补的链的基因扩增引物、含5’-agtctcytgttcgatcatctgm-3’或与其互补的链的基因扩增引物、以及所含链或其互补链包含上述序列的基因扩增引物。
可将包含上述序列的区和链或其互补链直接用作引物。此外，如果需要，引物中可包含其它序列如衔接序列。
本发明包括一种使用这些引物和探针以及其它试剂用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌或最小弧菌的试剂盒。
本发明所用的基因扩增方法不限于PCR方法。所述引物和探针可用于以引物特异性为基础的特异性扩增方法中或特异性抑制扩增的方法中。此外，所述引物和探针还可类似用于量化和扩增反应中，其中组合使用特异性扩增引物以及标记的特异性探针。此外，探针序列还可单独使用。使用探针的方法不限于包括固相或液相的方法。所述引物和探针还可用于进行实时PCR其中使用试剂如cyber绿检测扩增的双链DNA或进行应用FRET等的实时PCR。
使用有关本发明所得核苷酸序列的系统发育类群(图2、3和4)之间特异性的信息可设计出具有高度特异性的探针和具有高度特异性和极佳扩增效率的基因扩增引物。表2表示以关于本发明所得霍乱弧菌或最小弧菌(图2、3和4)的特异性核苷酸信息为基础制备的PCR引物的序列。
表2.特异性检测霍乱弧菌和最小弧菌的引物


已经获得有关系统发育类群的信息。因此，可设计出几乎全部所分析序列的特异性引物或探针。
后面将参考实施例详细描述本发明。每个实施例是本发明的一个实施方案，且本发明不受这些实施例的限制。
本说明书包括日本专利申请No.2002-362878的说明书或附图中公开的部分或全部内容，其是本申请的优先权文件。
附图简述图1表示连接gyrB和rpoD基因的部分序列后，分子系统发育分析的结果。这是通过邻接方法制备的分子系统发育树，表示霍乱弧菌和最小弧菌属于不同于弧菌属其它细菌那些类群的单一系统发育类群。此外，各霍乱弧菌和最小弧菌形成独立的单一系统发育类群。
图2表示霍乱弧菌和最小弧菌所属聚簇(图1所示)的gyrb基因共有序列(大写字母)与密切相关聚簇(图1中的C1、2和3)的gyrB基因共有序列(小写字母)的测定和比较结果。用“●”表示的位点是对霍乱弧菌和最小弧菌特异的核苷酸。
图3表示霍乱弧菌和最小弧菌所属聚簇(图1所示)的rpoD基因共有序列(大写字母)与密切相关聚簇(图1中的C1、2和3)的rpoD基因共有序列(小写字母)的测定和比较结果。用“●”表示的位点是对霍乱弧菌和最小弧菌特异的核苷酸。
图4表示霍乱弧菌所属聚簇(图1所示)的gyrB基因共有序列(大写字母)与最小弧菌所属聚簇(图1所示)的gyrB基因共有序列(小写字母)的测定和比较结果。用“●”表示的位点是对霍乱弧菌特异的核苷酸。
图5表示霍乱弧菌所属聚簇(图1所示)的rpoD基因共有序列(大写字母)与最小弧菌所属聚簇(图1所示)的rpoD基因共有序列(小写字母)的测定和比较结果。用“●”表示的位点是对霍乱弧菌特异的核苷酸。
图6表示最小弧菌所属聚簇(图1所示)的gyrB基因共有序列(大写字母)与霍乱弧菌所属聚簇(图1所示)的gyrB基因共有序列(小写字母)的测定和比较结果。用“●”表示的位点是对最小弧菌特异的核苷酸。
图7表示最小弧菌所属聚簇(图1所示)的rpoD基因共有序列(大写字母)与霍乱弧菌所属聚簇(图1所示)的rpoD基因共有序列(小写字母)的测定和比较结果。用“●”表示的位点是对最小弧菌特异的核苷酸。
进行本发明的最佳方式[实施例1]下面给出利用对霍乱弧菌和最小弧菌特异的区域，使用按照本发明设计和获得的基因扩增引物(表2所示)的例子。此外，权利要求
5(2)和(3)以及权利要求
11(2)和(7)描述的引物分别与表2中的CMgF、CMgR、CMrF、和CMrR相对应。使用从试验菌株中提取出来的染色体DNA作为模板、以及AmpliTaq Gold(PE Applied Biosystems)和总共20μl反应溶液进行PCR。关于热循环条件，是在95℃加热10分钟后，94℃ 1分钟循环35次、退火1分钟(见表5的退火温度)、和72℃ 1分钟，最后在72℃下进行延长反应10分钟。使反应后所得样品经过1％琼脂凝胶电泳，然后用溴化乙锭染色。是否存在扩增基因是在UV辐射下加以证实的。仅证实了来源于确定属于霍乱弧菌和最小弧菌的细菌菌株DNA的扩增产物，具有针对gyrB基因的CMgF和CMgR以及针对rpoD基因的CMrF和CMrR的组合(表6)。
下面给出利用对霍乱弧菌或最小弧菌特异的区域，使用按照本发明设计和获得的基因扩增引物(表3和表4所示)的例子。此外，权利要求
19(1)、(3)、(4)、和(5)以及权利要求
25(1)和(14)描述的引物对霍乱弧菌是特异性的。这些引物在表3中的CF1、CF2、CR2、CR1、CrF1、和CrR1描述。权利要求
33(1)、(3)、(4)、和(5)以及权利要求
39(7)和(13)描述的引物对最小弧菌是特异的。这些引物分别与表4中的MF1、MF2、MR2、MR1、MrF1、和MrR1相对应。
按照与实施例相似的方式，使用从试验菌株中提取出来的染色体DNA作为模板进行PCR(见表5的退火温度)。在所有情况下，使用霍乱弧菌-特异性引物仅检测来源于霍乱弧菌的扩增产物，而使用最小弧菌-特异性引物仅检测仅来源于最小弧菌的扩增产物(表6)。
表3.特异性检测霍乱弧菌的引物


表4.特异性检测最小弧菌的引物


表5.特异性检测霍乱弧菌和最小弧菌的引物的PCR条件


表6






此处引用的所有公开出版物、专利和专利申请全部引入此处作为参考。
工业实用性本发明的gyrB和rpoD基因引物和探针是以霍乱弧菌和最小弧菌的系统发育关系为基础设计的。因此，已经就提高特异性而研究了所述引物和探针且它们在检测准确性方面是极佳的。因此，所述引物和探针适用于在不从被密切相关的细菌种类污染的食品、临床样品等中分离细菌的情况下进行直接检测。
序列表<110>Nichirei Corporation<120>用于检测霍乱弧菌或最小弧菌的引物和探针以及使用它们的方法<130>PH-1967-PCT<140>
<141>
<150>JP 2002/362878<151>2002-12-13<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>885<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述霍乱弧菌和最小弧菌的共有序列-gyrB<400>1gtmtccggyg gtctrcacgg ggtaggtgtg tcggtrgtka aygcsctbtc wgaaaaagtg 60ctrctbacca tytatcgygg yggcaaraty caywcscaaa cttaccatca yggtgtgcca 120caagcaccgt tgkctgtrgt rggtgakacw gagcgtaccg gtactaccgt acgtttctgg 180ccwagygcac aracytttac caatatcgaa ttycattacg acattytggc taaacgyctg 240cgtgagctgt cattcctgaa ytctggcgtg tcgatcaagc tgaysgatga rcgtgaagaa 300gataaraaag accacttyat gtatgaaggk ggtattcaag cgtttgtkac ccacttgaac 360cgyaayaaaa cgccratcca tgaraaagtm ttccacttya accaagagcg tgaagatggc 420atcagcgtgg aagtggcrat gcagtggaay gatggtttcc aagaaaacat ctactgcttt 480acyaacaaca tyccacagcg tgatggyggt acccayttag cyggtttccg tggtgcrttg 540acccgtactt tgaacaacta yatggayaaa gaaggcttct cgaagaaagc scaagcrgca 600acctcgggtg atgatgcgcg tgaaggctta acrgcdgtkg tdtcggtgaa agtrccrgat 660cctaaattct cragccaaac caaagataag ctrgtttctt cggargtraa atccgcrgtt 720gartcagcya tgaatgagaa gctggcrgat ttcctrgcgg aaaacccaag cgaagcgaaa 780aacgtttgtt cgaagattat tgatgcrgcr cghgckcgtg aagcvgcgcg taaagcmcgk 840gaaatgacyc gycgtaaagg cgcgytrgay ythgcwggyt trcch 885<210>2
<211>822<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述霍乱弧菌和最小弧菌的共有序列-rpoD<400>2acacgtgaag gygaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccwtayattc ttgarcagtt tgaymrkgtt 120caggcmgaag arctacgtct sactgayctg atttcwggtt tcgttgaycc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaacygc kactcacatc ggttcwgarc tytctgaagc sgatctcgck 240gatgaagatg aygmkgtcgy sgargatgaa gacgargatg aagaygaaga yggcgacggt 300gaaagyagcg acagcgaaga agaagtsggt atygaccctg arctsgctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtmaycaag cwtctgaagc ktcarrcytr gtrytggata tyttccgyga attccgycta 480acaccaaarc aattygacca yttggttgaa actctgcgya cytcratgga tcgtgttcgy 540acccaagarc gyttggtrat gaaagcvgtr gttgaagtcg cgaaratgcc raagaaatcr 600ttyatygcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargart ggctbgataa agtvctygct 660tctgayaarc cttaygtasm raaagtmcgt gagcaagaag amgakatycg ccgytcaaty 720caraaactdc aratgatcga rcargagacw tcactgtctg ttgarcgyat caaagacatc 780agccgtcgta tgtcwatcgg tgargcraaa gctcgccgtg cg 822<210>3<211>822<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述霍乱弧菌的共有序列-gyrB<400>3acacgtgaag gygaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccwtayattc ttgarcagtt tgaymrkgtt 120caggcmgaag arctacgtct sactgayctg atttcwggtt tcgttgaycc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaacygc kactcacatc ggttcwgarc tytctgaagc sgatctcgck 240gatgaagatg aygmkgtcgy sgargatgaa gacgargatg aagaygaaga yggcgacggt 300gaaagyagcg acagcgaaga agaagtsggt atygaccctg arctsgctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtmaycaag cwtctgaagc ktcarrcytr gtrytggata tyttccgyga attccgycta 480acaccaaarc aattygacca yttggttgaa actctgcgya cytcratgga tcgtgttcgy 540acccaagarc gyttggtrat gaaagcvgtr gttgaagtcg cgaaratgcc raagaaatcr 600
ttyatygcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargart ggctbgataa agtvctygct 660tctgayaarc cttaygtasm raaagtmcgt gagcaagaag amgakatycg ccgytcaaty 720caraaactdc aratgatcga rcargagacw tcactgtctg ttgarcgyat caaagacatc 780agccgtcgta tgtcwatcgg tgargcraaa gctcgccgtg cg 822<210>4<211>822<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述霍乱弧菌的共有序列-rpoD<400>4acacgtgaag gtgaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccttatattc ttgagcagtt tgatcgtgtt 120caggccgaag agctacgtct cactgacctg atttcaggtt tcgttgaycc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaaccgc gactcacatc ggttctgagc tttctgaagc ggatctcgcg 240gatgaagatg atgctgtcgt cgaagatgaa gacgaagatg aagacgaaga tggcgacggt 300gaaagcagcg acagcgaaga agaagtcggt atcgaccctg aactggctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtcatcaag cttctgaagc gtcagactta gtgytggata tcttccgtga attccgycta 480acaccaaagc aattcgacca cttggttgaa actctgcgca cttcaatgga tcgtgttcgc 540acccaagaac gtttggtrat gaaagcggta gttgaagtcg cgaagatgcc gaagaaatcg 600ttcatcgccc tatttacagg caatgaatcg aatgaagagt ggctggataa agtccttgct 660tctgacaagc cttacgtagc gaaagtccgt gagcaagaag aagagatccg ccgttcaatt 720cagaaactac aaatgatcga gcaagagaca tcactgtctg ttgaacgcat caaagacatc 780agccgtcgta tgtcaatcgg tgaggcraaa gctcgccgtg cg 822<210>5<211>885<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述最小弧菌的共有序列-gyrB<400>5gtctccggtg gtctacacgg ggtaggtgtg tcggtagtga atgccctgtc agaaaaagtg 60ctgctbacca tttatcgtgg tggcaagatt cacacccaaa cttaccatca cggtgtgcca 120caagcaccgt tgtctgtrgt gggtgagact gagcgtaccg gtactaccgt acgtttctgg 180cctagtgcac agacttttac caatatcgaa ttccattacg acattctggc taaacgyctg 240cgtgagctgt cattcctgaa ctctggcgtg tcgatcaagc tgacggatga gcgtgaagaa 300gataagaaag accacttyat gtatgaaggt ggtattcaag cgtttgtkac ccacttgaac 360
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<223>人工序列的描述最小弧菌的共有序列-rpoD<400>6acacgtgaag gcgaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccatacattc ttgaacagtt tgacaaggtt 120caggcagaag aactacgtct gactgayctg atttctggtt tcgttgatcc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaactgc tactcacatc ggttcagarc tctctgaagc cgatctcgct 240gatgaagatg acgaggtcgc ggaggatgaa gacgaggatg aagatgaaga cggcgacggt 300gaaagyagcg acagcgaaga agaagtgggt attgaccctg agctcgctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggcaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtaaccaag catctgaagc ttcaagcctg gtactggata tyttccgcga attccgccta 480acaccaaaac aatttgacca tttggttgaa actctgcgta cctcgatgga tcgtgttcgt 540acccaagagc gyttggtgat gaaagcvgtg gttgaagtcg cgaaaatgcc aaagaaatca 600tttattgcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargaat ggctygataa agtrctcgct 660tctgataarc cttatgtaca aaaagtacgt gagcaagaag acgatattcg ccgctcaatc 720caaaaactkc agatgatcga acargagact tcactgtctg ttgagcgtat caaagacatc 780agccgtcgta tgtctatcgg tgaagcgaaa gctcgccgtg cg 822
权利要求
1.一种如SEQ ID NO1所示基因的片段，它是编码序列表中SEQID NO1的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)片段，并包含第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位(也称作核苷酸数)中的任意一个或多个核苷酸，上述位点对霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和最小弧菌(Vibrio mimicus)细菌类群是特异的，其中，所述基因片段可用于设计特异性基因扩增引物或探针。
2.一种基因扩增引物，它所含的链或其互补链含有15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码含有权利要求
1片段的序列表中SEQ ID NO1的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位中的任意位点，上述位点对霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群是特异的。
3.根据权利要求
2所述的基因扩增引物，其中使用高频含有权利要求
1所列霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群特异的两个或多个位点的区域。
4.根据权利要求
2所述的基因扩增引物，其中3’末端的核苷酸是位于权利要求
1所列霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群特异的位点上的核苷酸。
5.根据权利要求
2所述的基因扩增引物，它包括下列任何一个(1)5′-tycaywcscaaacttacca-3′或与其互补的链；(2)5′-gaaytctggcgtgtcgatcaag-3′或与其互补的链；(3)5′-catrtagttgttcaaagtacgg-3′或与其互补的链；(4)5′-ggatttyacytccgaagaaacyagc-3′或与其互补的链；(5)5′-ygccagcttctcattcatr-3′或与其互补的链；(6)5′-cgcttcgcttgggttttcc-3′或与其互补的链；或(7)5′-caataatcttcgaacaaacgt-3′或与其互补的链。
6.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌的探针，它所含的链或其互补链含有15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码序列表中SEQ ID NO1的DNA促旋酶β亚单位基因(gyrB)的第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位中的任意位点上，上述位点对霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群是特异的。
7.一种如序列表中SEQ ID NO2所示基因的片段，其包含编码SEQID NO2的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、或789位中任意一个或多个核苷酸，所述位点对霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群是特异的，其中所述基因片段可用于设计特异性基因扩增引物或探针。
8.一种基因扩增引物，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQID NO2中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码SEQ ID NO2的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、或789位中的任意位点上，所述位点对霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群是特异的。
9.根据权利要求
8所述的基因扩增引物，其中使用高频含有权利要求
8所列霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群特异的两个或多个位点的区域。
10.根据权利要求
8所述的基因扩增引物，其中3’末端的核苷酸是位于权利要求
8所列霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群特异的位点上的核苷酸。
11.根据权利要求
8所述的基因扩增引物，它包括下列任何一个(1)5′-gattgctgagtatcctggaaccatc-3′或与其互补的链；(2)5′-gaycctaacgacatggaaacc-3′或与其互补的链；(3)5′-ttcwgarctytctgaagcs-3′或与其互补的链；(4)5′-agatgaygmkgtcgysgar-3′或与其互补的链；(5)5′-cgacggtgaaagyagcgacag-3′或与其互补的链；(6)5′-caatgaactgcgcggyaagtt-3′或与其互补的链；(7)5′-gtcacgaccaaattcattaac-3′或与其互补的链；(8)5′-gyytgamgcttcagawgcttgrtka-3′或与其互补的链；(9)5′-ygargtrcgcagagtttcaacc-3′或与其互补的链；(10)5′-catyaccaarcgytcttgg-3′或与其互补的链；或(11)5′-cgytcaacagacagtgawgtc-3′或与其互补的链。
12.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群的探针，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQ ID NO2中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码SEQ ID NO2的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、或789位中的任意位点上，所述位点对霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群是特异的。
13.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群的方法，其中使用权利要求
2-6或8-12任何一项所述的引物或探针。
14.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群的试剂盒，其中使用权利要求
2-6或8-12任何一项所述的引物或探针。
15.一种如序列表中SEQ ID NO3所示的基因的片段，它包含编码SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中任意的一个或多个核苷酸，所述位点对霍乱弧菌细菌类群是特异的，其中所述基因片段可用于设计特异性基因扩增引物或探针。
16.一种基因扩增引物，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQID NO3中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位点上，所述位点对霍乱弧菌细菌类群是特异的。
17.根据权利要求
16所述的基因扩增引物，其中3’末端的核苷酸是位于权利要求
16所列对霍乱弧菌细菌类群独特的位点上的核苷酸。
18.根据权利要求
16所述的基因扩增引物，其中使用高频含有权利要求
16所列、对霍乱弧菌细菌类群特异的两个或多个位点的区域。
19.根据权利要求
16所述的基因扩增引物，它包括下列任何一个(1)5′-ggtggttaacgcgctytct-3′或与其互补的链；(2)5′-ycgatgaacgtgaagaagataaa-3′或与其互补的链；(3)5′-tgagaaagtcttccacttt-3′或与其互补的链；(4)5′-gttaaagtggaagactttc-3′或与其互补的链；或(5)5′-gggtaagccwgcaagatcc-3′或与其互补的链。
20.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌细菌类群的探针，它所含的链或其互补链含有15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码序列表中SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位点上，所述位点对霍乱弧菌细菌类群是特异的。
21.一种如序列表中SEQ ID NO4所示的基因的片段，它包含编码SEQ ID NO4的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位的任意一个或多个核苷酸，所述位点对霍乱弧菌细菌类群是特异的，其中所述基因片段可用于设计特异性基因扩增引物或探针。
22.一种基因扩增引物，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQID NO4中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码SEQ ID NO4的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位点上，所述位点对霍乱弧菌细菌类群是特异的。
23.根据权利要求
22所述的基因扩增引物，其中3’末端的核苷酸是位于权利要求
22所列对霍乱弧菌细菌类群独特的位点上的核苷酸。
24.根据权利要求
22所述的基因扩增引物，其中使用高频含有权利要求
22所列对霍乱弧菌细菌类群特异的两个或多个位点的区域。
25.根据权利要求
22所述的基因扩增引物，它包括下列任何一个(1)5′-attcttgagcagtttgatcgt-3′或与其互补的链；(2)5′-caggccgaagagctacgtctc-3′或与其互补的链；(3)5′-tgagctttctgaagcggatctcgcg-3′或与其互补的链；(4)5′-gaagatgatgctgtcgtcgaa-3′或与其互补的链；(5)5′-gaagatgaagacgaagat-3′或与其互补的链；(6)5′-cggtatcgaccctgaactg-3′或与其互补的链；(7)5′-catcaagcttctgaagcgtcaga-3′或与其互补的链；(8)5′-acggaagatatccarcactaa-3′或与其互补的链；(9)5′-tcaaccaagtggtcgaattgc-3′或与其互补的链；(10)5′-gcgaacacgatccattgaagtg-3′或与其互补的链；(11)5′-gatgaacgatttcttcggcatc-3′或与其互补的链；(12)5′-aaggactttatccagccac-3′或与其互补的链；(13)5′-ttcttcttgctcacggactttcgc-3′或与其互补的链；(14)5′-ttctgaattgaacggcggatc-3′或与其互补的链；或(15)5′-tgtctcttgctcgatcatttgt-3′或与其互补的链。
26.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌细菌类群的探针，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQ ID NO4中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码序列表中SEQ ID NO4的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位点上，所述位点对霍乱弧菌细菌类群是特异的。
27.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌细菌类群的方法，其中使用权利要求
16-20或22-26任何一项的引物或探针。
28.一种用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌细菌类群的试剂盒，其中使用权利要求
16-20或22-26任何一项的引物或探针。
29.一种如序列表中SEQ ID NO5所示的基因的片段，它包含编码SEQ ID NO5的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中任意一个或多个核苷酸，所述位点对最小弧菌细菌类群是特异的，其中所述基因片段可用于设计特异性基因扩增引物或探针。
30.一种基因扩增引物，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQID NO3中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位点上，所述位点对最小弧菌细菌类群是特异的。
31.根据权利要求
30所述的基因扩增引物，其中使用高频含有权利要求
30所列对最小弧菌细菌类群特异的两个或多个位点的区域。
32.根据权利要求
30所述的基因扩增引物，其中3’末端的核苷酸是位于权利要求
31所列对最小弧菌细菌类群独特的位点上的核苷酸。
33.根据权利要求
30所述的基因扩增引物，它包括下列任何一个(1)5′-ggtagtgaatgccctgtca-3′或与其互补的链；(2)5′-cggatgagcgtgaagaagataag-3′或与其互补的链；(3)5′-tgaaaaagtattccacttc-3′或与其互补的链；(4)5′-gttgaagtggaatactttt-3′或与其互补的链；或(5)5′-wggcaaaccagckarrtct-3′或与其互补的链。
34.一种用于检测、定量或鉴定最小弧菌细菌类群的探针，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQ ID NO5中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码SEQ ID NO5的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位点上，所述位点对最小弧菌细菌类群是特异的。
35.一种如序列表中SEQ ID NO6所示的基因的片段，它包含编码SEQ ID NO6的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意一个或多个核苷酸，所述位点对最小弧菌细菌类群是特异的，其中所述基因片段可用于设计特异性基因扩增引物或探针。
36.一种基因扩增引物，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQID NO6中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码SEQ ID NO6的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位点上，所述位点对最小弧菌细菌类群是特异的。
37.根据权利要求
36所述的基因扩增引物，其中使用高频含有权利要求
36所列对最小弧菌细菌类群特异的两个或多个位点的区域。
38.根据权利要求
36所述的基因扩增引物，其中3’末端的核苷酸是位于权利要求
36所列对最小弧菌细菌类群独特的位点上的核苷酸。
39.根据权利要求
36所述的基因扩增引物，它包括下列任何一个(1)5′-cattcttgaacagtttgacaag-3′或与其互补的链；(2)5′-caggcagaagaactacgtctg-3′或与其互补的链；(3)5′-agarctctctgaagccgatctcgct-3′或与其互补的链；(4)5′-gaagatgacgaggtcgcggag-3′或与其互补的链；(5)5′-gaggatgaagatgaagac-3′或与其互补的链；(6)5′-gggtattgaccctgagctc-3′或与其互补的链；(7)5′-taacaaagcatctgaagcttcaag-3′或与其互补的链；(8)5′-gcggaaratatccagtaccag-3′或与其互补的链；(9)5′-tcaaccaaatggtcaaattgt-3′或与其互补的链；(10)5′-acgaacacgatccatcgaggta-3′或与其互补的链；(11)5′-aataaatgatttctttggcatt-3′或与其互补的链；(12)5′-gagyactttatcragccat-3′或与其互补的链；(13)5′-gtcttcttgctcacgtactttttg-3′或与其互补的链；(14)5′-ttggattgaagggcgaata-3′或与其互补的链；或(15)5′-agtctcytgttcgatcatctgm-3′或与其互补的链。
40.一种用于检测、定量或鉴定最小弧菌细菌类群的探针，它所含的链或其互补链含有序列表中SEQ ID NO6中的15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于序列表中编码SEQ ID NO6的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位点上，所述位点对最小弧菌细菌类群是特异的。
41.一种用于检测、定量或鉴定最小弧菌细菌类群的方法，其中使用权利要求
30-34或36-40任何一项的引物或探针。
42.一种用于检测、定量或鉴定最小弧菌细菌类群的试剂盒，其中使用权利要求
30-34或36-40任何一项的引物或探针。
专利摘要
为了制备用于检测、定量或鉴定霍乱弧菌和最小弧菌的高性能特异性基因扩增引物，它具有较低的错误鉴定风险和实际应用中足够的扩增效率和扩增特异性。我们已经测定了霍乱弧菌、最小弧菌和密切相关种类的rpoD和gyrB基因的部分核苷酸序列，揭示了它们的系统发育关系，然后分别鉴定了霍乱弧菌和最小弧菌的核苷酸特征。因此，我们可设计出具有高度特异性的探针和具有高度特异性和极佳扩增效率的基因扩增引物，两者都包含特征核苷酸。
文档编号C12Q1/68GKCN1748030SQ200380109740
公开日2006年3月15日 申请日期2003年12月11日
发明者小泉雄史, 西山叶子, 山本敏, 福山正文, 古畑胜则, 大仲贤二 申请人:株式会社日冷食品导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan