专利名称:一种土壤总dna小量快速提取方法
技术领域：
本发明属于微生物学和分子生物学技术领域：
，具体涉及从土壤中小量快速提取总DNA的方法。
背景技术：
目前通常用于土壤总DNA提取的方法主要有间接法(Andrew E.Berry，Claudia Chiocchini，TinaSelby，Margherita Sosio，Elizabeth M.H.Wellington.(2003)Isolation of high molecular weight DNA from soil forcloning into BAC vectors.FEMS Microbiology Letters.22315-20)、直接法(Zhou，J.，Mary Ann Bruns，M.A.，andTiedje，M.J.(1996)DNA Recovery from Soils of Diverse Composition.Applied and Environmental Microbiology62(2)316-322)和试剂盒法(Q.BIOgene公司的FastDNA SPIN Kit for Soil)，中国发明专利申请公开说明书(公开号CN1456684A，专利申请号03120964.5)公开了“一种PCR-DGGE研究环境微生物群落的引物设计方案”，其提取土壤总DNA的方法也为直接法。从土壤中提取总DNA的间接法是先分离细胞再裂解，由于许多微生物与土壤颗粒紧密结合，细胞不易分离，导致最终的DNA产量低，还非常费时，此法一般少用；直接法是直接从土壤中裂解细胞，该法费时且效果一般；试剂盒法具有简单、快速，但价格昂贵，对大批样品的提取不经济。
发明内容
本发明的目的在于克服现有方法存在的缺陷，建立一种操作简单、快速、方便且价格经济的新方法。目前国内还没有土壤DNA提取试剂盒，该方法可用于制作试剂盒，在半小时左右提取比较纯的土壤总DNA，直接作为PCR的模板和酶切的底物，用于土壤微生物学和分子生物学的操作。
本发明通过以下技术方案实现本申请人发明了一种土壤总DNA小量快速提取的新方法。以土壤为材料，采取物理和化学方法共同裂解细胞释放DNA(即石英沙、二氧化硅粉末振荡和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)联用)，释放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高浓度硫氰酸根离子(SCN-)下可被硅藻土(主要成分为二氧化硅)吸附，当条件改变后，在弱碱性下DNA又被低盐缓冲液或去离子水洗脱出来，这样得到的DNA具有足够的纯度和量用于PCR和酶切反应。
本发明包括以下步骤本发明的主要步骤包括细胞裂解、DNA抽提和纯化。其具体步骤如下(1)制作裂解管称取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗涤，然后用去离子水洗涤并浸泡过夜，再在80℃下烘干，精确称取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，装入2ml的离心管，121℃灭菌30分钟；(2)称取土样0.5克到步骤(1)的裂解管中，加裂解缓冲液(裂解缓冲液的制备0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1MH3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃灭菌30分钟后加CTAB，使其终浓度为1％(克/毫升))1毫升后混匀；(3)用胶带将裂解管固定在旋涡混合仪(产自江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司，产品型号为QL-901型)上振荡5分钟；(4)在10,000×g下离心1分钟后将尽可能多的上清液转至一洁净的1.5毫升离心管中；(5)在10,000×g下离心2分钟后小心吸取上清液0.4毫升到一洁净的2毫升离心管中，将吸附基质悬浮液(吸附基质悬浮液的制备0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6左右，再加用稀硝酸洗涤和去离子水浸泡过夜并在80℃下烘干的硅藻土，使其终浓度为5％(克/毫升))摇匀后加1毫升；(6)手动轻轻摇匀2分钟，使DNA与吸附基质充分结合；(7)在10,000×g下离心10秒后小心弃去上清液0.8毫升，将吸附基质重新悬浮后全部吸取，移到含收集管的离心纯化柱(离心纯化柱购买自上海赛百盛基因技术有限公司)上；(8)在10,000×g下离心1分钟收集沉淀，倒去收集管中的废液；(9)在离心纯化柱上加0.5毫升洗涤液(洗涤液的制备12ml 3M NaAc与100ml乙醇混合后调pH值至7.0)，在10,000×g下离心1分钟洗涤基质，倒去收集管中的废液，再在10,000×g下离心2分钟以除去残留的洗涤液；(10)将离心纯化柱转至一洁净的1.5毫升离心管中，于室温下干燥2分钟；(11)在离心纯化柱中间加100微升TE缓冲液(TE缓冲液的制备10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，121℃灭菌30分钟)或去离子水，用手指轻弹管壁1分钟以保证DNA的充分洗脱，在10,000×g下离心1分钟收集DNA；(12)以步骤(11)抽取的DNA为模板，以16S rDNA引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’，(Gentry，T.J.，Wang，G.，Rensing，C.and Pepper I.L.(2004).Chlorobenzoate-degrading bacteria in similar pristine soilsexhibit different community structures and population dynamics in response to anthropogenic 2-，3-，and4-chlorobenzoate levels.Microb.Ecology 48，90-102)和1492R 5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’(Wilson，K.H.，Blitchington，R.B.and Green，R.C.(1990)Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chainreaction.Journal of.Clinical Microbiology 28，1942-1946)为引物扩增出土壤16S rDNA并进行电泳检测；(13)用EcoR I和Pst I对步骤(11)提取的DNA作双酶切并进行电泳检测。
图1是用3种不同方法提取同一样品土壤总DNA的电泳检测图。图中编号1-3依次为直接法、试剂盒法和本发明方法提取的DNA，点样量均为10ul。DNA Marker I的分子量标准从上至下依次为15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp(bp碱基对，北京天为时代科技有限公司，目录号MD115-01)。
图2是用3种不同方法提取同一样品土壤总DNA做PCR扩增的产物电泳检测图。1-3依次为直接法、试剂盒法和本发明方法提取的DNA不稀释做模板，4-6依次为3种方法提取的DNA稀释10倍做模板，点样量均为10ul。DNA Marker II的分子量标准从上至下依次为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp(bp碱基对，北京天为时代科技有限公司，目录号MD109-01)。
图3是用本发明方法提取的DNA的酶切产物电泳检测图。1为未酶切的DNA，2为酶切的DNA，点样量分别为5ul和20ul(DNA的量相同)。
图4是用本发明方法提取自然林地、人工林地和水田土壤DNA的电泳检测图。1-3依次为3种土样的DNA，点样量均为10ul。
本发明的积极效果如表1表1本发明与直接法和试剂盒法与的实施效果比较
具体实施方式
实施例1从旱耕入为土(Orthic Anthrosols)中提取总DNA实验土壤取自中国湖北省武汉市华中农业大学附属中学运动场表层土样(该土壤分类为旱耕入为土，pH＝5.87，分类命名为Orthic Anthrosols)，取样后过2毫米×2毫米孔径的筛，然后-20℃保存待用。具体操作步骤如下(1)制作裂解管称取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗涤，然后用去离子水洗涤并浸泡过夜，再在80℃下烘干，精确称取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，装入2ml的离心管，121℃灭菌30分钟；(2)称取土样0.5克到步骤(1)的裂解管中，加裂解缓冲液(裂解缓冲液的制备0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1MH3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃灭菌30分钟后加CTAB，使其终浓度为1％(克/毫升))1毫升后混匀；(3)用胶带将裂解管固定在旋涡混合仪(产自江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司，产品型号为QL-901型)上振荡5分钟；(4)在10,000×g下离心1分钟后将尽可能多的上清液转至一洁净的1.5毫升离心管中；(5)在10,000×g下离心2分钟后小心吸取上清液0.4毫升到一洁净的2毫升离心管中，将吸附基质悬浮液(吸附基质悬浮液的制备0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6左右，再加用稀硝酸洗涤和去离子水浸泡过夜并在80℃下烘干的硅藻土，使其终浓度为5％(克/毫升))摇匀后加1毫升；(6)手动轻轻摇匀2分钟，使DNA与吸附基质充分结合；(7)在10,000×g下离心10秒后小心吸弃上清液0.8毫升，重悬基质后全部吸起(约0.6毫升)，移到含收集管的离心纯化柱(离心纯化柱购买自上海赛百盛基因技术有限公司)上；(8)在10,000×g下离心1分钟收集沉淀，倒去收集管中的废液；(9)在离心纯化柱上加0.5毫升洗涤液(洗涤液的制备12ml 3M NaAc与100ml乙醇混合后调pH值至7.0)，在10,000×g下离心1分钟洗涤基质，倒去收集管中的废液，再在10,000×g下离心2分钟以除去残留的洗涤液；(10)将离心纯化柱转至一洁净的1.5毫升离心管中，于室温下干燥2分钟；(11)在离心纯化柱中间加100微升TE缓冲液(TE缓冲液的制备10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，121℃灭菌30分钟)或去离子水，用手指轻弹管壁1分钟以保证DNA的充分洗脱，在10,000×g下离心1分钟收集DNA；为了比较本发明与现有的直接法和试剂盒法的平行效果，申请人同时进行了利用直接法和试剂盒法的实验，利用直接法从土壤中提取总DNA按照Zhou报道的方法进行(Zhou，J.，Mary Ann Bruns，M.A.，and Tiedje，M.J.(1996)DNA Recovery from Soils of Diverse Composition.Applied and Environmental Microbiology62(2)316-322)；利用试剂盒法从土壤中提取总DNA所用试剂盒购自Q.BIOgene公司，试剂盒的商品名称为FastDNA SPIN Kit for Soil。上述两种方法使用的土壤样品同本发明，即样品处理都用0.5g土样提取其DNA，然后将提取的DNA溶于100微升的TE缓冲液中。
如图1所示，采用直接法、试剂盒法和本发明的方法从土壤中提取的总DNA结果有较大差别，前两种方法提取的总DNA产量相当，本发明的方法较高(采用常用分光光度计检测的总DNA产量约为10ug)，比前两种方法均高出1倍。
实施例2对实施例1提取的DNA做PCR检测用本实施例1提取的DNA为模板，以设计的引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’和1492R5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，扩增土壤微生物16S rDNA(16S核糖核蛋白体RNA基因)。利用间接法、试剂盒法和本发明的方法制备的土壤总DNA不稀释和稀释10倍作PCR反应的模板分别来扩增土壤微生物的16S rDNA。PCR反应体系如下(50ul)ddH2O34.5ul；DNA2ul；10×PCR buffer(TaKaRa)5ul；10×MgCl2(TaKaRa)5ul；dNTP(Promega，每种10mM)1ul；16S rDNA引物338F(50ng/ul)1ul；16S rDNA引物1492R(50ng/ul)1ul；Taq Enzyme(TaKaRa，5U/ul)0.5ul。PCR程序如下预变性94℃ 5分钟；变性94℃ 45秒；退火49℃ 45秒；延伸72℃ 1.5分钟；最后延伸72℃ 10分钟；循环数35个。
扩增的目的DNA片段大小为1151bp，如图2所示，在1500bp和1000bp之间第3到第6泳道有强带，第1和第2泳道无带，这表明直接法和试剂盒法提取的DNA不可以直接作模板做PCR扩增；经过10倍稀释后可以做PCR扩增，而本发明的方法提取的DNA不稀释和稀释10倍完全可以满足做PCR的要求。
实施例3对使用本发明方法提取的DNA做酶切检测对实施例1中用本发明方法提取的DNA做EcoR I(G↓AATTC)和Pst I(CTGCA↓G)双酶切(参考文献J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南.第三版.科学出版社.2003)。酶切体系(20ul)ddH2O11ul；10×H buffer(TaKaRa)2ul；EcoR I(TaKaRa，15U/ul)1ul；Pst I(TaKaRa，15U/ul)1ul；DNA5ul。酶切条件37℃过夜。由图3可以看出酶切后的DNA呈现一片连续的带形，证明DNA被切成小片段，为smear状，说明用本发明方法提取的DNA可以满足酶切的要求。
实施例4应用本发明的方法从不同类型土壤样品中提取土壤总DNA按照实施例1的方法分别提取3种土样的DNA中国湖北省武汉市华中农业大学狮子山的自然林地土壤(pH＝6.65)和华中农业大学人工林地土壤(pH＝6.46)，两种土壤均为湿润雏形土，分类命名为Udic Cambisols；中国湖北省大冶市金矿附近的水田土壤(pH＝7.12)，该土壤为水耕入为土，分类命名为Stagnic Anthrosols。电泳检测图如图4所示，由图4看出，本实施例中的3种土样都能制备出质量比较好的DNA，其发明效果如表2所示。
表2应用本发明对不同类型的土壤总DNA的制备效果
权利要求
1.一种土壤总DNA的小量快速提取方法，其主要步骤包括样品制备、PCR和电泳，具体步骤如下(1)制作裂解管称取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗涤，然后用去离子水洗涤并浸泡过夜，再在80℃下烘干，精确称取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，装入2ml的离心管，121℃灭菌30分钟；(2)称取土样0.5克到步骤(1)的裂解管中，加裂解缓冲液1毫升后混匀；(3)用胶带将裂解管固定在旋涡混合仪上振荡5分钟；(4)在10,000×g下离心1分钟后将尽可能多的上清液转至一洁净的1.5毫升离心管中；(5)在10,000×g下离心2分钟后小心吸取上清液0.4毫升到一洁净的2毫升离心管中，将吸附基质悬浮液摇匀后加1毫升；(6)手动轻轻摇匀2分钟，使DNA与吸附基质充分结合；(7)在10,000×g下离心10秒后小心弃去上清液0.8毫升，将吸附基质重新悬浮后全部吸取，移到含收集管的离心纯化柱上；(8)在10,000×g下离心1分钟收集沉淀，倒去收集管中的废液；(9)在离心纯化柱上加0.5毫升洗涤液，在10,000×g下离心1分钟洗涤基质，倒去收集管中的废液，再在10,000×g下离心2分钟以除去残留的洗涤液；(10)将离心纯化柱转至一洁净的1.5毫升离心管中，于室温下干燥2分钟；(11)在离心纯化柱中间加100微升TE缓冲液或去离子水，用手指轻弹管壁1分钟以保证DNA的充分洗脱，在10,000×g下离心1分钟收集DNA；(12)以步骤(11)抽取的DNA为模板，以16S rDNA引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’和1492R5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’为引物扩增出土壤16S rDNA并进行电泳检测；(13)用EcoR I和Pst I对步骤(11)提取的DNA作双酶切并进行电泳检测。
2.权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的裂解缓冲液按以下步骤制备0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1M H3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃灭菌30分钟后加十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，使其终浓度以克/毫升计为1％。
3.权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的吸附基质悬浮液按以下步骤的制备0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6.0，121℃灭菌30分钟后加用稀硝酸洗涤和去离子水浸泡过夜并在80℃下烘干的硅藻土，使其终浓度以克/毫升计为5％。
4.权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的洗涤液按以下步骤制备将12ml 3M NaAc与100ml乙醇混合后调pH至7.0。
专利摘要
本发明公开了一种土壤总DNA的小量快速提取方法。以土壤为材料，采取石英沙、二氧化硅粉末振荡和十六烷基三甲基溴化铵共同裂解细胞释放DNA，释放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高浓度硫氰酸根离子下可被硅藻土吸附，当条件改变后，在弱碱性下DNA又被低盐缓冲液或去离子水洗脱出来，这样提取的DNA具有足够的纯度和量用于PCR和酶切反应。主要步骤包括裂解细胞、抽提DNA和纯化DNA三步。本发明具有简单、快速、方便、提取的DNA纯度高和价格便宜等优点，而且可应用于试剂盒的制作，在半小时左右提取比较纯的土壤总DNA，用于土壤微生物学和分子生物学研究。
文档编号C12Q1/68GKCN1990863SQ200510120584
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日
发明者王革娇, 蔡林 申请人:华中农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan