专利名称:可同化降解氯化、甲硫基化以及甲氧基化三嗪类农药的新型微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有降解选自甲硫基化三嗪类化合物(西草净(simetryn)、莠灭净(ametryn)、扑草净(prometryn)、排草净(dimethametryn)、舌夂草净(desmetryne)以及特丁净(terbutryn))、氯化三嗪类化合物(西玛津(simazine)、莠去津(atrazine)、扑灭津(propazine)以及特丁津(terbuthylazine))、以及甲氧基化三嗪类化合物(西玛通 (simetone)、莠去通(atraton)以及扑灭通(prometon))的组中的至少1种物质的能力的新型微生物，更详细地说，涉及一种属于类诺卡氏菌(Nocardioides)属的微生物，还涉及使用该微生物或含有该微生物的复合微生物类降解上述三嗪类化合物的方法。
背景技术：
近代农业中，农药是维持、稳定产量以及减少劳动力、削减生产成本所必不可少的。但事实表明，使用的农药的一部分流入河川、湖泊、地下水、用水等，担心对整体环境中的生物造成影响。土壤中栖息着多种多样的微生物，其中存在降解农药等有机化学物质、具有无害化处理能力的微生物。但是，由于这些降解菌在自然环境中的存在密度低、并且分布也不均勻，所以通常对于有机污染物质在环境中的蓄积和扩散还没有做到防患于未然。因此认为，将这种降解菌从土壤中选择性地富集并分离培养，然后对农药等有机污染物质进行降解的方法，即所谓的生物修复(bioremediation)法是有效的方法。
多年以来，三嗪类化合物作为农药、消泡剂或染料等在世界上得到广泛应用，但是现在作为环境污染物质引起关注。已知有多种微生物降解氯化三嗪类农药莠去津(专利文献1)。另一方面，以西草净为代表的甲硫基化三嗪类农药以及以西玛通为代表的甲氧基化三嗪类农药的降解难度更高，有关通过微生物降解甲硫基化三嗪以及甲氧基化三嗪的报道有限。据报道，Cook和Hutter使用以莠灭净或扑草净作为硫源配制的合成培养基，从土壤中富集降解菌，最终挑选出增殖速度快的3种细菌(非专利文献1)。使其中的2种降解莠灭净、另外的1种降解莠灭净和扑草净，生成脱甲硫基化的代谢物。但是，并没有关于这些菌株在菌学方面的研究报道。另外，据报道，Mrong等从受到高浓度莠去津污染的垃圾堆存处分离具有莠去津降解能力的金黄节杆菌(ArthrcAacter aurescens)TCl株，表明金黄节杆菌TCl株在含有以莠灭净或扑草净作为唯一氮源的培养基中生长(非专利文献幻。另外，Shapir等将来自金黄节杆菌TCl株的莠去津降解酶基因导入大肠杆菌中，使用获得表达的酶来降解莠灭净(非专利文献幻。据报道，Topp等将类诺卡氏菌属C190株的菌体或菌体提取物分散到含有西草净、莠灭净、扑草净或特丁净的溶液中，在厌氧条件下保温静置时，确认它们被降解，生成脱甲硫基化的代谢物(非专利文献4)。另外，据报道，Seffernick 等用密执安棍状杆菌(ClavibactermichiganensisMTZl株的菌体提取物使莠灭净脱甲硫基化(非专利文献5)。
如上所述，虽然有一些关于使用微生物降解三嗪类化合物的报道，但现状是分离株在菌学方面的研究不充分，没有表明活菌体中的降解或降解速度、降解需要其他碳源等，
3目前还不能说存在可以用于生物修复的菌株。
专利文献1 特开2005-27536号
非专利文献 1 :Cook, A.M. ；Hutter, R.，1982，Appl. Environ. Microbiol. 43, 781-786。
非专禾丨J 文献 2 :Strong, L. C. ；Rosendahl, C. Johnson, G. ；Sadowsky, M. J.； ffackett, L. P. ,2002,Appl Environ Microbiol.，68，5973-5980。
非专利文献 3 :Shapir, N. ；Rosendahl, C. ；Johnson, G. ；Andreina, M. ；Sadowsky, M. J. ；ffackett, L. P. , 2005, Appl. Environ. Microbiol.，71，2214—2220。
非专利文献4 =Topp, Ε. ；Mulbry, W. Μ. ；Zhu, H. ；Nour, S. Μ. ；Cuppels, D.，2000， Appl. Environ. Microbiol. ,66,3134—3141。
非专利文献 5 :Seffernick, J. L. Johnson, G. ；Sadowsky, Μ. J. ；ffackett, L. P.， 2000，Appl. Environ. Microbiol.，66，4247-4252。
发明内容
本发明的目的在于提供能够降解甲硫基化三嗪类化合物(西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净或特丁净等)、氯化三嗪类化合物(西玛津、莠去津、扑灭津或特丁津等) 以及甲氧基化三嗪类化合物(西玛通、莠去通、扑灭通等)的新型微生物，以及使用该微生物降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的方法。
本发明人等发现从土壤中分离的类诺卡氏菌属的细菌中，存在具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力的细菌。另外，发现该细菌具有特征性的16S rRNA基因，从菌学性质方面看也是新型的细菌。进一步地，发现通过使用该细菌，通过单一菌株除了可以有效降解原来降解困难的西草净等甲硫基化三嗪类化合物、甲氧基化三嗪类化合物之外，还可以有效降解氯化三嗪类化合物。
因此，本发明涉及以下[1] [13]。
一种类诺卡氏菌属的细菌，其特征在于，所述细菌具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
如[1]所述的细菌，其中，所述甲硫基化三嗪类化合物为选自西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净以及特丁净的组中的1种以上。
如[1]或[2]所述的细菌，其中，所述氯化三嗪类化合物为选自西玛津、莠去津、扑灭津以及特丁津的组中的1种以上。
如[1] [3]任一项所述的细菌，其中，所述甲氧基化三嗪类化合物为选自西玛通、莠去通以及扑灭通的组中的1种以上。
一种类诺卡氏菌属的细菌，其中，所述细菌具有包含下述(A)或(B)的16S rRNA 基因
(A)由序列编号1所示的碱基序列构成的DNA ；
(B)与序列编号1所示的碱基序列具有95%以上同一性的DNA，且具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
类诺卡氏菌属MTD22株(保藏编号!7ERM P-20989 ；保藏编号FERM BP-10849)，其中，所述MTD22株具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。
甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的降解方法，其中，所述方法使用了 [1] [6]任一项所述的细菌。
如[7]所述的降解方法，其中，所述甲硫基化三嗪为选自西草净、莠灭净、排草净、 敌草净、特丁净以及扑草净的组中的1种以上。
如[7]或[8]所述的降解方法，其中，所述氯化三嗪为选自莠去津、西玛津、扑灭津以及特丁津的组中的1种以上。
如[7] [9]任一项所述的降解方法，其中，所述甲氧基化三嗪为选自莠去通、西玛通以及扑灭通的组中的1种以上。
一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化方法，其中，所述净化方法使用了 [1] [6]任一项所述的细菌。
—种用于降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物的三嗪类化合物用降解剂，其中，所述降解剂含有至少1种[1] [6]任一项所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化剂，其中，所述净化剂含有至少1种[1] [6]任一项所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
S卩，本发明涉及一种类诺卡氏菌属的细菌，其具有降解甲硫基化三嗪类化合物、 氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力，优选具有降解西草净、莠灭净、扑草净、排草净、敌草净、特丁净、西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津、西玛通、莠去通以及扑灭通的能力。更详细地说，涉及一种类诺卡氏菌属的细菌，其具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力，优选具有降解西草净、莠灭净、 扑草净、排草净、敌草净、特丁净、西玛津、莠去津、扑灭津、特丁津、西玛通、莠去通以及扑灭通的能力，其特征在于，16S rRNA基因具有序列表的序列编号1所示的碱基序列，或者以不损害降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力为限度，通过缺失、取代或添加1个或多个碱基，与序列表中序列编号1所示的碱基序列具有 95%以上同源性的碱基序列。作为属于该类诺卡氏菌属的三嗪降解菌的具体例子，例如有类诺卡氏菌属 MTD22 株(FERM P-20989 ；FERM BP-10849)。
如上所述，本发明首先涉及一种类诺卡氏菌属的细菌，其具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力。作为这种细菌，优选具有包含下述㈧或⑶的16S核糖体RNA基因
(A)由序列编号1所示的碱基序列构成的DNA ；
(B)与序列编号1所示的碱基序列具有95%以上同一性的DNA。
而且，优选具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物的能力的类诺卡氏菌属的细菌。上述同一性优选95%以上，更加优选96%以上，进一步优选97%以上，进一步优选98%以上，进一步优选99%以上，特别优选99. 5% 以上，特别优选99. 8 %以上，特别优选99. 9 %以上。作为这种细菌，例如有类诺卡氏菌属 MTD22 株(FERM P-20989 ；FERM BP-10849)。
另外，本发明涉及一种甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的降解方法，所述降解方法使用具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌。
进一步，本发明涉及一种含有具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌以及该细菌生长可接受的载体的组合物，用于降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物(三嗪类化合物用降解剂)。
进一步，本发明涉及一种净化含有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/ 或甲氧基化三嗪类化合物的环境的方法，所述方法使用具有降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌。
本发明中，“净化环境”的意思是指所谓的生物修复，是指从因含有难以降解的化学物质而受到污染的土壤、地下水和/或用水等中降解除去该化学物质。
另外，本发明涉及一种用于净化含有甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的环境的组合物，所述组合物含有具有降解甲硫基化三嗪、 氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的能力的属于类诺卡氏菌属的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
通过使用本发明的甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌，能够降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物。进一步，使用本发明的细菌，可迅速降解该化合物，能够迅速有效地降解废弃农药和环境中的残留农药。 本发明为由三嗪类化合物引起的环境污染提供新的环境净化方法，即提供新的生物修复方法。
图1表示为富集本发明的降解菌而使用的装置的模式图。
图2表示如图1所示装置的A D各装置的回流液中，西草净的浓度变化图。
图3表示通过实施例3中本发明的降解菌MTD22株降解三嗪类化合物的图。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式进行说明。本发明是关于从土壤中分离的甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌。本发明中的甲硫基化三嗪是指三嗪骨架上具有甲硫基的甲硫基化三嗪类化合物。作为本发明的甲硫基化三嗪的优选例子，例如有西草净(2，4_双(乙氨基)-6-甲硫基-S-三嗪)、排草净0-(1，2- 二甲基丙氨基)-4-乙氨基-6-甲硫基-S-三嗪)、扑草净(2，4_双(异丙氨基)-6-甲硫基-S-三嗪)、莠灭净(2-乙氨基-4-异丙氨基-6-甲硫基-S-三嗪)、敌草净(2-异丙氨基-4-甲氨基-6-甲硫基-S-三嗪)、特丁净(2-叔丁氨基-4-乙氨基-6-甲硫基-S-三嗪)、格草净(methoprotryne， 又称甲氧丙净)(2-异丙氨基-4-(3-甲氧丙基)-6-甲硫基-S-三嗪)等。另外，氯化三嗪是指三嗪骨架上具有氯基的氯化三嗪类化合物。作为本发明的氯化三嗪的优选例子， 例如有西玛津O-氯-4，6-双(乙氨基)-s_三嗪)、莠去津(2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-S-三嗪)、扑灭津(2-氯-4，6-双(异丙氨基)-s_三嗪)、特丁津(2-叔丁氨基-4-氯-6-乙氨基-S-三嗪)、氰草津(cyanazine) (2-(1-氰基甲基乙氨基)_4_乙氨基-6-氯-S-三嗪)、环丙津(cypraz ine) (2_氯_4_环丙氨基_6_异丙氨基_s_三嗪)、草达津(trietazine) (2-氯-4-二乙氨基-6-乙氨基_s_三嗪)、欧阿津(norazine) (2-氯-4-异丙氨基-6-甲氨基-S-三嗪)、抑草津(ipazine) (2-氯-4- 二乙氨基_6_异丙氨基_s_三嗪)、丙胺津(proglinazine-ethyl) (2-氯-6-乙氧羰基甲氨基-4-异丙氨基_s_三嗪)、可乐津(chlorazine) (2-氯-4，6-双(二乙氨基)_s_ 三嗪)、另丁津(sebuthylazine) (2-仲丁氨基-4-氯-6-乙氨基-S-三嗪)、MPMT (4，6-双(3-甲氧丙氨基)_2_甲硫基_s_三嗪)、SD-15417 (2-氯-4-(1-氰基-异丙氨基)-6-甲氨基_s_三嗪)等。另外，甲氧基化三嗪是指三嗪骨架上具有甲氧基的甲氧基化三嗪类化合物。作为本发明的甲氧基化三嗪的优选例子，例如有莠去通O-乙氨基4-异丙氨基-6-甲氧基-S-三嗪)、西玛通(2，4-双 (乙氨基)-6-甲氧基-S-三嗪)、草怕通(ipatone) (2-二乙氨基4-异丙氨基-6-甲氧基-S-三嗪)、Noratone (2-异丙氨基-4-甲氨基-6-甲氧基_s_三嗪)、扑灭通(2，4-双 (异丙氨基)-6-甲氧基-S-三嗪)、仲丁通(secbumetone) (2-仲丁氨基_4_乙氨基-6-甲氧基-S-三嗪)、醚草通(methometon) (2-甲氧基_4，6_双(3-甲氧丙氨基)_s_三嗪)、特丁通(terbumeton) (2-叔丁氨基-4-乙氨基-6-甲氧基-s_三嗪)等。
本发明的对于甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪具有降解能力的属于类诺卡氏菌属的细菌中，包含具有下述菌学特征。
A.形态性质(使用培养基=Difco制造的R2A琼脂；培养温度30°C ；培养时间48 小时)
(1)细胞形态球菌
(2)大小直径 Ι.Ομ 1·2μ
(3)孢子无
(4)运动性无
B.菌落形态(使用培养基=Difco制造的R2A琼脂；培养温度30°C ；培养时间48 小时)
(1)菌落直径1.0mm
(2)色调淡黄色
(3)形状圆形
(4)隆起状态透镜状
(5)边缘全缘
(6)表面的形状平滑
(7)透明度不透明
(8)粘稠度黄油状
C.生理学性质
(1)革兰氏染色+
(2)37°C时的生长_
(3)25°〇时的生长+
(4)过氧化氢酶+
(5)氧化酶_
(6)葡萄糖产酸/气体-/_[0066](7)0汗试验-/-
D.生化性状试验(采用BioMerieux制造的API Coryne)
(1)硝酸盐还原_
(2)吡嗪酰胺酶+
(3)吡咯烷酮芳基酰胺酶_
(4)碱性磷酸酶_
(5) β -葡糖苷酸酶_
(6)0-半乳糖苷酶_
(7) α -葡糖苷酶+
(S)N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶_
(9)七叶苷+
(10)尿素酶_
(11)明胶水解+
(12)葡萄糖同化性_
(13)核糖同化性_
(14)木糖同化性_
(15)甘露糖醇同化性_
(16)麦芽糖同化性_
(17)乳糖同化性_
(18)蔗糖同化性_
(19)糖原同化性_
作为对象的甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪降解菌的具体例子，有新型分离菌株类诺卡氏菌属MTD22株。类诺卡氏菌属MTD22株被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，微生物的标记(保藏者提交的用于识别的标记)为“Nocardioides sp. strain MTD22 (类诺卡氏菌属MTD22株)”，保藏编号为“FERM P-20989”，保藏日期为2006年(平成18年)8月11 日，进一步于2007年(平成19年)7月4日移交国际保藏，保藏编号为FERM BP-10849。
根据后述实施例1记载的方法，本发明人等发现了能够降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪以及甲氧基化三嗪的新型的MTD22株。适于该微生物降解各三嗪化合物的培养基如表 1所示。
[表 1]
无机培养基1的组成
Na2HPO4 · 12H20L2g
KH2PO40.5 g
NH4NO30.5 g
微量元素溶液IOml
混合维生素溶液Iml
水1000 ml
8[0091]上述表1中的微量元素溶液的组成如下表2所示。
[表 2]
微量元素溶液的组成 EDTA · 2Na MgSO4 · 7H20 FeSO4 · 7H20 ZnSO4 · 7H20 Γ一 1MnSO4 · H2O
权利要求
1.类诺卡氏菌属(Nocardioidessp. )MTD22株的细菌，保藏编号为FERM P-20989以及 FERM BP-10849。
2.甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的降解方法，其中，所述方法使用权利要求
1所述的细菌。
3.如权利要求
2所述的降解方法，其中，所述甲硫基化三嗪类化合物为选自西草净、莠灭净、排草净、敌草净、特丁净以及扑草净的组中的1种以上。
4.如权利要求
2所述的降解方法，其中，所述氯化三嗪类化合物为选自莠去津、西玛津、扑灭津以及特丁津的组中的1种以上。
5.如权利要求
2所述的降解方法，其中，所述甲氧基化三嗪类化合物为选自莠去通、西玛通以及扑灭通的组中的1种以上。
6.一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化方法，其中，所述净化方法使用权利要求
1所述的细菌。
7.一种用于降解甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物的三嗪类化合物用降解剂，其中，所述降解剂含有权利要求
1所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
8.一种受到甲硫基化三嗪、氯化三嗪和/或甲氧基化三嗪类化合物污染的土壤、地下水和/或用水的净化剂，其中，所述净化剂含有权利要求
1所述的细菌以及该细菌生长可接受的载体。
专利摘要
本发明提供能够降解作为农药等常用的甲硫基化三嗪类化合物(特别是西草净、排草净或扑草净)、氯化三嗪类化合物(特别是西玛津、莠去津或扑灭津)以及甲氧基化三嗪类化合物(特别是西玛通、莠去通、扑灭通)等的新型微生物，以及使用该微生物降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的方法。本发明提供具有降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物以及甲氧基化三嗪类化合物能力的新型细菌类诺卡氏菌属MTD22株，以及使用该细菌降解甲硫基化三嗪类化合物、氯化三嗪类化合物和/或甲氧基化三嗪类化合物的方法，特别是降解西草净、排草净、扑草净、西玛津、莠去津、扑灭津、西玛通、莠去通和/或扑灭通等的方法。
文档编号A62D101/28GKCN101548007 B发布类型授权 专利申请号CN 200780040279
公开日2011年10月12日 申请日期2007年11月20日
发明者原田直树, 岩崎昭夫, 藤井邦彦, 高木和广 申请人:兴和株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),