无血清植物蛋白肽通用细胞培养基的制作方法

专利名称：:无血清植物蛋白肽通用细胞培养基的制作方法无血清植物蛋白肽通用细胞培养基
技术领域：
：本发明涉及无血清或低血清通用细胞培养基。技术背景细胞是病毒、蛋白的表达载体，细胞质量直接影响表达量，只有好的培养基才能筛选、驯化出优质细胞。普通的细胞培养基中含有小牛血清，由于血清都是批量生产，各批间差异很大、质量不稳定，而且血清中含有一些对细胞产生毒性的物质，会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡，同时也更加了工业化生产中分离纯化的难度；而且特别不适合生长因子对细胞作用的研究、细胞分泌物功能的研究及大量细胞分泌物的制备。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。虽然目前已有无血清培养基问世，但是在原代培养或者细胞生长状况不良时还是只能先用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后才能再换成现有无血清培养液；而且多数细胞转入现有的无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，直至无血清培养。由于目前的无血清培养基包含非常少的蛋白质，所以更易于受外界因素的影响，并缺乏血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，容易导致所培养细胞的致死性损害。
发明内容本发明的目的是为了解决现有无血清培养基不能直接培养生长状况不良的细胞，多数细胞要逐步降低血清浓度才能适应现有的无血清培养基及易受外界因素影响、容易造成致死性损害的问题，而提供的一种无血清植物蛋白肽通用细胞培养基。本发明1000mL无血清植物蛋白肽通用细胞培养基由200mg氯化牵丐、400mg氯化钾、97.67mg无水硫酸镁、6800mg氯化钠、121.74mg无水磷酸二氢钠、292mgL-谷氨酰胺、lOOOmgD-葡萄糖、10mg酚红、lmgD-泛酸钙、lmg氯化胆碱、lmg叶酸、2mgi-肌醇、lmg烟酰胺、lmg盐酸吡哆醛、O.lmg核黄素、lmg盐酸硫胺、5000mg大豆蛋白肽和余量的蒸馏水制成。本发明无血清植物蛋白肽通用细胞培养基中所使用的大豆蛋白肽按中国专利"大豆蛋白活性肽的制作方法"(专利号ZL00110471.3，公开号CN1273783A)的方法制备。本发明无血清植物蛋白肽通用细胞培养基中所使用的大豆蛋白肽由微生物发酵法制备；因活性微生物菌体直接参与生化代谢，所以可以将大分子的大豆蛋白分解为更具有活性的小分子肽，在配置培养基的过程中大豆小分子肽在水溶液中会形成具有生物活性的大分子大豆蛋白肽，可以代替血清中的动物源性蛋白和因子。现有无血清培养基中添加的蛋白多是酶解蛋白，由于酶只能机械的切割肽键导致目前的无血清培养基蛋白类营养物质种类少、不均衡，难以使生长状况不良细胞的存活。本发明中的植物大豆蛋白肽经活性微生物菌体的生化代谢，所以蛋白种类多、营养均衡；而且在本发明通用培养基大豆蛋白肽中还含有微生物的初级代谢产物和次级代谢产物，可为所培养的细胞提供各种所需的生长因子，由于采用的是植物蛋白和微生物发酵手段，所以可以有效的避免动物源性对所培养动物或人细胞的干扰。细胞可直接在本发明无血清植物蛋白肽通用细胞培养基上培养而不必逐步驯化和培养，节省了培养周期和其它因素的干扰；并且使用本发明无血清植物蛋白肽通用细胞培养基细胞成活率高达94%以上。采用本发明无血清植物蛋白肽通用细胞培养基简化了后期的分离纯化工艺，使杂质含量降低，提高产品纯度，降低生产成本。图1是具体实施方式二中无血清植物蛋白肽通用细胞培养基中培养的HaLe细胞形态图片，图2是具体实施方式二中普通MEM细胞培养基中培养的HaLe细胞形态图片。具体实施方式具体实施方式一本实施方式1000mL无血清植物蛋白肽通用细胞培养基由200mg氯化钙、400mg氯化钾、97.67mg无水硫酸镁、6800mg氯化钠、121.74mg无水磷酸二氢钠、292mgL-谷氨酰胺、1000mgD-葡萄糖、10mg酚红、lmgD-泛酸钙、lmg氯化胆碱、lmg叶酸、2mgi-肌醇、lmg烟酰胺、lmg盐酸吡哆醛、O.lmg核黄素、lmg盐酸硫胺、5000mg大豆蛋白肽和余量的蒸馏水制成。按中国专利"大豆蛋白活性肽的制作方法"(专利号ZL00110471.3，公开号CN1273783A)制备出的大豆蛋白活性肽的色泽微乳白色或淡黄色、具有滋气味、粉状无结块；在原专利中大豆蛋白活性肽仅被用于食品加工。此大豆蛋白活性肽制备方法工艺稳定、产品质量波动小、质量高。经检测大豆中富含18种氨基酸、其中8种主要氨基酸平衡，本实施方式培养基中使用的大豆蛋白肽可完全替代血清培养基中的氨基酸组分，同时微生物发酵而产生的肽类物质为细胞提供了更为重组和全面的营养，也减轻了后期分离纯化的工作压力。本实施方式可用于培养CHO细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、杂交瘤细胞、HEK293细胞、MDCK细胞、HeLa细胞、MDBK细胞等细胞。对于培养基中必须添加血清培养的特殊细胞(如Marcl45细胞、BHK21细胞、VERO细胞、骨髓间充质干细胞等)，在本发明无血清植物蛋白肽通用细胞培养基中添加低量血清(<3%质量)后即可实现成功培养(现有血清培养基中血清加入量为质量的8%10%)。本实施方式无血清植物蛋白肽通用细胞培养基可增加所培养细胞的密度及收获次数，提高表达量，从而提高医药领域的疫苗产量；并解决因取消或降低小牛血清的使用而造成的细胞过早死亡，形态不饱和问题。本实施方式因为采用大豆蛋白，其成本远远低于使用牛血清的培养基，并同时解决了现有无血清培养基培养细胞过早死亡、形态不饱和的问题。而且使用本实施方式无血清植物蛋白肽通用细胞培养基培养的细胞不易发生老化脱落现象，细胞增殖迅速、代谢旺盛。具体实施方式二本实施方式用无血清植物蛋白肽通用细胞培养基HaLe细胞(非洲女性宫颈癌细胞)。本实施方式HaLe细胞由八一农垦大学动物科技学院实验室液氮保存。分别使用具体实施方式一本实施方式无血清植物蛋白肽通用细胞培养基和普通MEM细胞培养基(产品代码MD600，批号070512)在37"C的条件下直接培养复苏后的HaLe细胞，并用显微镜观察各组细胞形态及生长增殖情况。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>无血清植物蛋白肽通用细胞培养基中培养的细胞分裂百分率明显优于普通MEM细胞培养基，并且无血清植物蛋白肽通用细胞培养基中细胞长成单层的时间与传统培养基相同，而且细胞形态基本一致(HaLe细胞在不同培养基中的形态分别如图1和图2所示)。无血清植物蛋白肽通用细胞培养基的营养成分优于普通血清培养基，无血清植物蛋白肽通用细胞培养基中细胞增殖迅速，代谢旺盛，细胞分裂百分率(24h)明显高于普通血清培养基。说明具体实施方式一无血清植物蛋白肽通用细胞培养基在细胞培养中可行。权利要求1、无血清植物蛋白肽通用细胞培养基，其特征在于1000mL无血清植物蛋白肽通用细胞培养基由200mg氯化钙、400mg氯化钾、97.67mg无水硫酸镁、6800mg氯化钠、121.74mg无水磷酸二氢钠、292mgL-谷氨酰胺、1000mgD-葡萄糖、10mg酚红、1mgD-泛酸钙、1mg氯化胆碱、1mg叶酸、2mgi-肌醇、1mg烟酰胺、1mg盐酸吡哆醛、0.1mg核黄素、1mg盐酸硫胺、5000mg大豆蛋白肽和余量的蒸馏水制成。专利摘要无血清植物蛋白肽通用细胞培养基，它涉及无血清或低血清通用细胞培养基。它解决了现有无血清培养基不能直接培养生长状况不良的细胞，多数细胞要逐步降低血清浓度才能适应现有的无血清培养基及易受外界因素影响、容易造成致死性损害的问题。无血清植物蛋白肽通用细胞培养基由氯化钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、酚红、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺、大豆蛋白肽和蒸馏水制成。细胞可直接在本发明培养基上培养而不必逐步驯化和培养，节省了培养周期和其它因素的干扰；减少血清带来的病毒污染；并且细胞成活率高达94％以上。文档编号C12N5/12GKCN101245335SQ200810064156公开日2008年8月20日申请日期2008年3月21日发明者雷王,王东典,王淑杰申请人:乐能生物工程股份有限公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan