一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法

专利名称:一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域：
，具体涉及一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法。背景技术：
苦马豆素是一种吲哚里西啶生物碱，其抗肿瘤活性、免疫增强作用及其抗辐射作用是十分明显的，然而制约国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程的主要问题是苦马豆素来源十分困难，远远不能满足人们研究的需要。
目前苦马豆素的来源有三种途径，第一种是从豆科黄芪属、棘豆属植物和苦马豆属植物，以及旋花科番薯属、锦葵科黄花稔属植物中提取。由于植物本身含苦马豆素的量很低，提取率低，产量有限，难以满足需求；第二种是通过人工合成途径得到，合成产物存在同分异构现象，而且有手性化合物，使得分离很困难，产率低，并不适宜大规模的工业化生产；第三种方法是从真菌菌丝体或培养基中提取即生物合成。在目前获取苦马豆素的三种途径中，
人工合成途径是人们研究的重点。自美国化学家Yasuda(1984)、Bennett (1989)等先后报道人工合成苦马豆素以来，人们采用了不同的方法合成苦马豆素，可分为以下四种①Mootoo(2001)的合成方法，关键步骤是使用氨水使二乙醛酮(keto-bisaldehyde)的氨基化降低了 3倍，以保证目标物质只有一种对映异构体。该法以2， 3， 5， 6-二-0-甘露呋喃糖(2， 3:5， 6-di-0-mannofuranose)为起始物，共需13步，产率为15%。②Trost (1999)和Katsuki (2000)报道的不对称合成法，以二元醇为起始物，分别需要17步和11步，产率为13%和10%。③Pearson(2002)报道的改进后的方法。以异抗坏血酸(D-isoascorbic acid)为起点，共需10步，产率为12%。 Blechert (2002) ， Carretero(2000)， Pyne (2002)等报道的以吲哚里西據顺二羟基亮氨酸(syn-dihydroxylation) 衍生物开始，分别需要15步，18步和16步，产率分别为38%(以内消旋二元 醇开始计算)，6.5%和4.5%。中国科学院院士周维善等(1993)人工合成苦马 豆素也获成功，但产率很低。
前两种方法(从植物中提取和化学合成)，由于产量低，不能满足人们对 苦马豆素抗肿瘤活性研究及其产品开发的需要。因此，探索通过产量高、提 取成本低且保护环境的微生物发酵途径获取苦马豆素，就成为目前人们关注 的研究热点。这就是第三种方法从真菌菌丝体或培养基中提取即生物合成。 关于苦马豆素的生物合成，目前国内申请的专利有3项即"生物发酵提纯苦 马豆素的工艺"、"绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺"和"白僵菌发酵生产苦 马豆素的工艺"。
① "生物发酵提纯苦马豆素的工艺"是由杨凌大农生物技术有限公司申 请，中国专利公开号CN1396263，
公开日2003年2月12日，发明创造的名称 为"生物发酵提纯苦马豆素的工艺"，其所采用的微生物菌株是自行从自然界 豆科植物中分离、筛选的可产生苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)。其 存在的不足和缺陷是，在专利中没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方 法和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体生物学特性、标准、以 及品质鉴定方法。这样使得同领域的普通技术人员无法按说明书的内容重复 实现。
② "绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺"是由西北农林科技大学申请，专利申请号200610043120.5，所提供的菌种是从中国农业科学院微生物菌种保 存中心购买的标准绿僵菌Ofe^m^'zj'^朋iso; h'ae)。该专利保护的主要内 容是苦马豆素的提取技术工艺，而不涉及绿僵菌本身的分离方法。绿僵菌在 自然界中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，在中 国农业科学院微生物菌种保存中心也有保藏。
③"白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺"是由杨凌天力生物技术有限公司 申请，专利申请号200710199249. X，所提供的菌种是从中国农业科学院微生 物菌种保存中心购买的标准白僵菌(Seai/i^r/a y^ss&"a Vuill)，编号为 ACCC30112,也可以是其它渠道获得的白僵菌。该专利保护的主要内容也是苦 马豆素的提取技术工艺，而不涉及白僵菌本身的分离方法。白僵菌在自然界 中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，在中国农业 科学院微生物菌种保存中心也有保存。
后两项技术方案在实际操作中存在的共同问题是l、白僵菌和绿僵菌虽 然可以从国家菌种保存中心购买，来源方便，但其产生苦马豆素的量比较低;2、 在保存菌种的过程中存在菌株变异问题,即发生菌株变异时，不仅导致生产损 失,同时为了后续的再生产,还必须重新购买菌种,带来不必要的麻烦。

发明内容
本发明提供一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法，以解决现有技术存 在的产量低、菌株变异造成损失的问题。
为了解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是， 一种产苦马豆素 的内生真菌的分离方法包括下述步骤 一、分离用去离子水洗去甘肃棘豆 (采自于青藏高原)表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花分离，然后将叶、茎、花分别用纱布包扎，进行表面消毒，表面消毒的程序为首 先用70%的乙醇浸泡30 s，再用有效氯含量为1 %的次氯酸钠溶液浸泡3 min,最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次1 min，将该去离子水接种于新 制的PDA或Czapek琼脂培养基表面，观察30 d，看该培养基表面是否有真菌 生长，以此来检验表面消毒的效果；
用灭菌的滤纸将经表面消毒的植物组织上的水分吸去，然后用灭菌的剪 刀将叶、茎、花等分别剪成3mm大小的组织块，然后分别用灭菌的镊子将各 组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18。C培养；待组织块周围长出 适当大小的菌落时，挑取边缘菌丝接种于PDA琼脂培养基表面，置培养箱中 18 。C培养；若在PDA培养基上生长的菌落仍未纯化时，将其再次接种于新制 的PDA培养基表面，重复此操作过程，直至得到纯化的菌株。将分离到的真 菌编号，分别接种于PCA斜面，于4 'C中保存；二、采用经典的薄层色谱技 术筛选。
上述筛选的具体做法是将分离得到的内生真菌菌株接种于Czapek培养 基上，2(TC 25。C通气发酵培养10 14天,收集菌丝体，干燥保存备用；将 干燥的内生真菌菌丝用研钵研磨成粉末，用滤纸包裹，放入索氏抽提器中， 用乙醇75。C回流提取4小时，重复提取3次，合并乙醇提取液；乙醇提取液 分别浓縮挥干，用去离子水将其溶解，加入5 cm长的D101大孔树脂柱。先用 去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，并将其浓縮挥干。然后用甲醇将其溶 解，制成待检液；用毛细管将苦马豆素标准品、内生真菌菌丝待检液分别点 样于GF254硅胶薄层板上，用V氯仿:V甲醇:V氨水:V水=70:26:2:2展开剂上行法展 开。待展开剂到达薄层板前沿时，将其取出挥干溶剂，在薄层板表面喷洒HA置110。C加热10min，再将醋酐喷洒于硅胶板表面，置ll(TC加热10min，最后喷洒Ehrlich' s试剂，置ll(TC加热10min，然后观察待检样品是否具有与苦马豆素标准品的颜色和Rf值相同的斑点。若有与苦马豆素标准品一致的斑点，即可初步确定待检样品中含有苦马豆素，说明这种内生真菌就是产苦马豆素的菌株。
内生菌是指在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的微生物。植物内生菌种类包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等。几乎所有植物中都有生活的内生菌，它们与植物形成共生或互生的关系，这种共生关系表现在植物光合作用为内生菌提供必需的物质基础，而内生菌代谢又为植物提供氧料。正是这种共生关系， 一方面为植物生长提供养料，促进植物生长，另一方面使得宿主植物对环境表现适应性，对环境胁迫表现出一定的抗性(如抗干旱、抗病虫害等)，有的还对食草动物表现出毒性，以维持其生存的需要。
植物内生菌虽然来源于环境微生物，但由于植物体和内生菌以及内物菌间长期的相互作用，其遗传和代谢特性也与环境微生物产生差别。它能产生环境微生物所不能产生的全新物质，这些物质可能具有某些特异的生物活性(如抗肿瘤活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗病虫活性等)，因而被越来越多地应用于医药业和农业等领域。最新研究表明，疯草中活性物质-苦马豆素的产生是由其内的内生真菌所致。据不完全统计，我国西部草地疯草类植物约有45种，主要分布于内蒙古、甘肃、青海、新疆、西藏、陕西、宁夏、四川等西部省区，分布面积已超过1100万hm2，植物资源十分丰富。
本发明提供了一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法，这样所带来的技术效果体现在以下几个方面
1、 从疯草中分离的产苦马豆素的内生真菌，其产生苦马豆素的量远高于其他来源的菌株。
2、 本发明提供的分离方法简便易行，在保存菌种的过程中发生菌株变异，也可以重新从自然界疯草中分离得到。
3、 本专利提供的内生真菌的分离方法，可以有效解决国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程中苦马豆素来源十分困难的现状，以满足人们研究的需要，同时为进一步的大规模生产提供了坚实的基础。


图1是构建5. 8S r DNA-ITS序列的系统发育树。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明进行详细地说明。一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法，包括下述步骤一、分离用去离子水洗去甘肃棘豆(采自于青藏高原)表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花分离，然后将叶、茎、花分别用纱布包扎，进行表面消毒，表面消毒的程序为首先用70%的乙醇浸泡30 S,再用有效
氯含量为l %的次氯酸钠溶液浸泡3 min，最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次l min，将该去离子水接种于新制的PDA或Czapek琼脂培养基表面，观察30 d，看该培养基表面是否有真菌生长，以此来检验表面消毒的效果；
用灭菌的滤纸将经表面消毒的植物组织上的水分吸去，然后用灭菌的剪刀将叶、茎、花等分别剪成3 mm大小的组织块,然后分别用灭菌的镊子将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18t:培养；待组织块周围长出适当大小的菌落时，挑取边缘菌丝接种于PDA琼脂培养基表面，置培养箱中18'C培养；若在PDA培养基上生长的菌落仍未纯化时，将其再次接种于新制的PDA培养基表面，重复此操作过程，直至得到纯化的菌株。将分离得到的6
株内生真菌编号，分别接种于pca斜面，于4 t:中保存；
二、采用经典的薄层色谱技术筛选将分离得到的内生真菌菌株接种于Cz即ek培养基上，2(TC 25。C通气发酵培养10 14天,收集菌丝体，干燥保存备用；将干燥的内生真菌菌丝用研钵研磨成粉末，用滤纸包裹，放入索氏抽提器中，用乙醇75 'C回流提取4小时，重复提取3次，合并乙醇提取液；乙醇提取液分别浓縮挥干，用去离子水将其溶解，加入5 cm长的D101大孔树脂柱。先用去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，并将其浓縮挥干。然后用甲醇将其溶解，制成待检液；用毛细管将苦马豆素标准品、内生真菌菌丝待检液分别点样于GF254硅胶薄层板上，ffl V氛仿:V甲醇:V氣水:V水=70:26:2:2展开剂上行法展开。待展开剂到达薄层板前沿时，将其取出挥千溶剂，在薄层板表面喷洒&02置ll(TC加热lOmin，再将醋酐喷洒于硅胶板表面，置ll(TC加热10min,最后喷洒Ehrlich' s试剂，置ll(TC加热10min，然后观察待检样品是否具有与苦马豆素标准品的颜色和Rf值相同的斑点。见下表。
产苦马豆素内生真菌的筛选
菌株编号培养基种类展开剂HA/醋酐/Ehrlich， s试剂显色特性
Cz即ek培养基V氯仿V甲醉V氨水V水 (70:26:2:2)无紫红色显色斑点
卿L -2Cz邻ek培养基V氯仿V甲醉V氨水V水 (70:26:2:20淡紫红色显色斑点，Rf值为0.45，与 苦马豆素标准品一致
卿L -3Cz邻ek培养基V氯仿V甲醉V氨水' V水 (70:26:2:2)无紫红色显色斑点
QHFL -4Cz邻ek培养基V氯仿V甲醇V氨水V水紫红色显色斑点，Rf值为0.45，与苦
10(70:26:2:2)马豆素标准品一致
QHFL -5Cz即ek培养基V氛仿' V甲醉V氨水' V水 (70:26:2:2)淡紫红色显色斑点，Rf值为0.45，与 苦马豆素标准品一致
QHFL -6Cz邻ek培养基V氣仿V甲醉V氨水V水 (70:26:2:2)无紫红色显色斑点
从上表可以发现有3株内生真菌即QHFL-2、 QHFL-4、 QHFL-5有与
苦马豆素标准品一致的斑点，即可初步确定待检样品中含有苦马豆素，说明这种内生真菌就是产苦马豆素的菌株可产生苦马豆素(分离率50%=3/6)。从显色特性及颜色深浅判断，这批中QHFL-4菌株产生苦马豆素的活性最好。
取QHFL -4进行下面的实验
(一)计算菌丝体中苦马豆素的含量
准确称取一定量的苦马豆素标准品用吡啶配制成0. 0016 5. 102 g/L系列质量浓度的标准品溶液，精确量取100 u L各标准品溶液，分别加入20 u L1 mg/mL的内标(甲基化-a-D-甘露糖苷)溶液，混匀，最后加入40 uL硅烷化(BSTFA+ TMCS)试剂，置干燥器中室温进行硅烷化反应30min，进行气相色谱测定。
气相色谱仪日本岛津公司生产的GC-14C气相色谱仪，威玛龙色谱工作站。
色谱条件SE30石英毛细管柱(30mX0. 25mm， 0. 33 y m)，柱温280 。C，进样口温度300 。C，氢火焰离子化检测器(FID)温度280 °C，载气为氮气，流速为2 mL/min，进样1 y L，分流比30 : 1。
标准曲线绘制以苦马豆素标准样品的峰面积和内标峰面积之比为横坐标x、以苦马豆素的质量浓度(mg/mL)为纵坐标y，绘制标准曲线，得到标准曲线方程y=0.265x+0.017 (相关系数r=0.9987)，苦马豆素的质量浓度在0.013 1.563 g/L范围内呈良好的线性关系。
GSFL-4内生真菌菌株菌丝体中苦马豆素含量测定经薄层色谱技术初步筛选的能产生苦马豆素的QHFL-4内生真菌菌株菌丝体待检液离心，除去不溶物后挥干，用吡啶溶解，分别依次加入内标溶液和硅垸化试剂，置干燥器中室温进行硅垸化反应30 min，然后luL进样，进行气相色谱分析。样品溶液中苦马豆素峰面积与内标峰峰面积的比值代入标准曲线方程，计算出样品溶液中苦马豆素的含量，最后计算出菌丝体中苦马豆素的含量为3.210g/kg。(二)产苦马豆素内生真菌的鉴定
①QHFL-4内生真菌菌株形态学特征
将筛选得到的产苦马豆素的QHFL-4内生真菌菌株接种于PDA平板上，置18。C恒温培养15天，观察菌落的颜色、形状、气生菌丝的疏密程度。并挑取少许菌丝于载玻片上，水或棉兰乳酸酚作浮载剂，观察并记录真菌的分生孢子梗及其分生孢子的形态，测量分生孢子的大小。
菌落底部逐渐由白色变为黄褐色、黑褐色、黑色，菌落呈绒状，中央凸起，气生菌丝较密集。分生孢子稀少，单个散在分布，形态、大小不一，多呈直的圆柱形，少数呈卵圆形，有的呈膝状弯曲。分生孢子呈褐色，边缘光滑，具有暗色的横膈膜，横膈数为1 4个，无纵膈，孢子大小为20 60X6 10um。
②GSFL-4内生真菌rDNA-ITS序列分析
刮取PDA琼脂培养基表面生长的QHFL-4内生真菌的菌丝，用液氮研磨，然后用TAKARA公司提供的Universal Genomic DNA Extraction Kit提取真菌基因组DNA，提取的DNA浓度用Biophotometer测定。采用引物ITS1和ITS4扩增5.8S rDNA-ITS片段，该片段包括ITS1、 5. 8S rDNA、 ITS2的全部序列以及18S rDNA、 28S rDNA的部分序列。PCR反应体系为 50 u L: TaKaRa Taq 2. 5 U， 10XPCR Buffer 5 u L， MgC12 3 u L， dNTP Mixture 4 uL,引物各2uL，模板DNA0.5 u L,加双蒸水至50 u L;反应条件为 95 。C预变性5 min， 95 。C变性30 s， 55 。C退火30 s， 72 。C延伸l min, 30个 循环，最后72 'C延长10 min使其完全反应。将PCR产物加入l. 5 %的琼脂糖 凝胶中电泳，电泳后在凝胶成像系统中进行分析，5.8S rDNA-ITS序列的长度 一般为500 700 bp。电泳后，将扩增所得的5.8S rDNA-ITS片段从琼脂糖凝 胶的胶块上切下，然后用TaKaRa Gel DNA Purification Kit回收。将回收的 5.8S rDNA-ITS片段与T-载体(TaKaRa pMD19-T Vector)连接，再将5. 8S rDNA-ITS序列和T-载体的连接复合物转化DH5ci型感受态大肠杆菌。将转化后 的DH5 a型感受态大肠杆菌涂布于含有Amp、 IPTG、 X-gal的LB琼脂培养基表面， 置37 i:培养18-24 h，挑取白色的单个菌落做菌落PCR，反应体系和条件与上 所述相同，若菌落PCR产物经凝胶电泳后，出现5.8S rDNA- ITS对应条带，将 该单个菌落接种于LB液体培养基中培养过夜，用TaKaRa MinBEST Plasmid Purif ication质粒提取试剂盒提取含有5. 8SrDNA-ITS片段的质粒。
提取的质粒经适当稀释后用BigDye Teminator v3. 1测序试剂盒进行测 序，测序引物为M13-47。测序产物经纯化后在ABI PRISM 3730XL序列分析仪 上进行序列测定。登录http〃www. ncbi.nlm.nih.gov，将测定的5.8S rDNA-ITS序列用BLAST与Genbank中的5.8S rDNA-ITS序列进行同源性比较， 以假球壳科(Pleosporaceae)的链格孢属(j"er朋ria)、匍柄霉属 (5^e顺力7^'咖)、假格孢属(T^7/^a)、埃里格孢属(f/z7力e7"w'a)、细基格孢属(WocZg^/i/yz7)、突脐蠕孢属(fxsero力j7"/Z7)、平脐蠕孢属(^//whn's)、 弯孢属(0/rw/7aWa)、内脐蠕孢属(Z recAs7era)等属的菌株序列构建系 统发育树。应用ClustalX 1.83 version对选取的序列进行排列，然后利用 MEGA 4.0软件采用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，自展
法检测发育树，自展数据集为iooo次。
应用通用引物ITS1,ITS4扩增的片段通过凝胶电泳分析，扩增片段长度 约为600 bp，该片段包括ITS1、 5.8SrDNA、 ITS2的全部序列和18S rDNA、 28S
rDNA的部分序列。
经核苷酸序列测定，QHFL-4的扩增片段共为602 bp， 5. 8S rDNA-ITS序 列的GenBank登录号为EU604066，其31 547为5. 8S rDNA-ITS序列，BLAST 比对结果显示QHFL-4与^76e7Jj'w'a L12同源性高达99% ，仅有2个位点 核苷酸不同，与Z"e277ar&、 A;z7力e7h^j'a、 WocZ3d/z'"/z 等属的一些种同源性 也在95%以上。对QHFL-4与^"ei7 aria、 6^e历/ Ar乃'MZ7、 7VY历力ya、 f/^e〗7&ia、 Woc7ao7亂7&5"ez"o^7咖、A/poZarz'5"、 C〃rK〃7arz'a、 Z recAs7era等属40个 序列进行系统发育分析。
由图l可以看出，系统发育树可以明显将其分成A、 B、 C、 D四个大组-y^tei7 arj'3、 ^fiM e^j'sia、 Woa/a(3^i/yz7、 7Vz'辺力ya构成一个较大的复合组A Z rec力s2era禾口 ■SYe/Hp/y^/j'LWH分另lj构成B、 C纟且，￡xse_ro/ i7L 、 ^z'/ o/ari5、 Car^/Zai^a构成D组，其中甘肃棘豆内生真菌QHFL-4与；5z必e77j'w'a印.L12 的遗传距离最近，与i5M eJ"w'a、 X7z^ra3rj'a、 Woc7aA7加等属中的一些成 员的遗传关系较近，而与v5rec/ 57era、5^e顺力/iii/fl7、^xser。/ j7亂^z'; c^ari5"、 O/TFZ/hn'a的遗传关系较远。说明QHFL-4内生真菌属于埃里格孢属真菌。本发明分离得到产苦马豆素的内生真菌，经形态学和分子生物学鉴定为 属于埃里格孢属真菌，为生物发酵生产苦马豆素奠定了重要理论依据。
本发明也为埃里格孢属真菌提供了一种新的用途，可以做为生物发酵生 产苦马豆素的目的菌株。
权利要求
1、一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法，包括下述步骤一、分离用去离子水洗去甘肃棘豆(采自于青藏高原)表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花分离，然后将叶、茎、花分别用纱布包扎，进行表面消毒，表面消毒的程序为首先用70％的乙醇浸泡30s，再用有效氯含量为1％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次1min，将该去离子水接种于新制的PDA或Czapek琼脂培养基表面，观察30d，看该培养基表面是否有真菌生长，以此来检验表面消毒的效果；用灭菌的滤纸将经表面消毒的植物组织上的水分吸去，然后用灭菌的剪刀将叶、茎、花等分别剪成3mm大小的组织块，然后分别用灭菌的镊子将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18℃培养；待组织块周围长出适当大小的菌落时，挑取边缘菌丝接种于PDA琼脂培养基表面，置培养箱中18℃培养；若在PDA培养基上生长的菌落仍未纯化时，将其再次接种于新制的PDA培养基表面，重复此操作过程，直至得到纯化的菌株。将分离到的真菌编号，分别接种于PCA斜面，于4℃中保存；二、采用经典的薄层色谱技术筛选。
2、 如权利要求
1所述的一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法，其特征在 于所述筛选的具体做法是将分离得到的内生真菌菌株接种于Czapek培养基 上，2(TC 25t:通气发酵培养10 14天，收集菌丝体，干燥保存备用；将干燥 的内生真菌菌丝用研钵研磨成粉末，用滤纸包裹，放入索氏抽提器中，用乙醇 75 r回流提取4小时，重复提取3次，合并乙醇提取液；乙醇提取液分别浓縮 挥干，用去离子水将其溶解，加入5 cm长的D101大孔树脂柱。先用去离子水洗 脱树脂柱，收集水洗脱液，并将其浓縮挥干。然后用甲醇将其溶解，制成待检液；用毛细管将苦马豆素标准品、内生真菌菌丝待检液分别点样于GF254硅胶 薄层板上，用V鄉:V申醇:V駄:V水二70:26:2:2展开剂上行法展开。待展开剂到达 薄层板前沿时，将其取出挥干溶剂，在薄层板表面喷洒H力2置ll(TC加热10min， 再将醋酐喷洒于硅胶板表面，置ll(TC加热10min，最后喷洒Ehrlich， s试剂， 置ll(TC加热10min,然后观察待检样品是否具有与苦马豆素标准品的颜色和 Rf值相同的斑点。若有与苦马豆素标准品一致的斑点，即可初步确定待检样品 中含有苦马豆素，说明这种内生真菌就是产苦马豆素的菌株。
专利摘要
本发明属于生物制药技术领域：
，具体涉及一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法。本发明为解决现有技术存在的产量低、菌株变异造成损失的问题，现采用的技术方案是，一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法，包括下述步骤一、分离离子水去尘，分离叶、茎、花，表面消毒，吸水、切割，然后分别将各组织块接种于培养基表面，培养箱中培养；待周围长出菌落时，挑取边缘菌丝接种于琼脂培养基表面，置培养箱中培养；若在PDA培养基上生长的菌落仍未纯化时，再次接种于培养基表面，重复此操作过程，直至得到纯化的菌株，二、采用经典的薄层色谱技术筛选。发明的优点如下1.提取效率高、2.方法简便、易行。
文档编号C12N1/14GKCN101503658SQ200910021405
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月6日
发明者刘彬慧, 来航线, 贺武利, 赵宝玉, 尧 马 申请人:杨凌天力生物技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan