专利名称:人工肾前体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及人工肾前体及其制备方法。
背景技术：
肾是产生红细胞生成素的主要器官；伴随肾衰竭的红细胞生成素产生的减少引起作为并发症的肾性贫血。
近年来，已提出作为用于肾性贫血的下一代治疗方法的方法，其中通过再生医学技术制备具有产生红细胞生成素潜力的人工肾或其前体，并将其移植至肾性贫血患者。例如，专利文件I公开了一种用于制备产生红细胞生成素的类器官(人工肾)前体的方法，其包括以下步骤:将分离的得自哺乳动物的间充质干细胞移植入怀孕的哺乳动物宿主体内的胚胎中或分离自怀孕的哺乳动物宿主的胚胎中，从而诱导间充质干细胞分化，其中将间充质干细胞移植入的部位为胚胎的肾发生部位，并且移植的时机对应于其中宿主的免疫系统仍为免疫耐受的时期。
然而该方法中存在的问题为程序复杂，因为其需要正好在将人工肾前体移植至患者之前自怀孕的哺乳动物中采集羊水，并确认前体的生物安全性。此外，间充质干细胞必须注入胚胎中的可在将来形成肾的合适部位，这种操作需要高技巧。另外，因为间充质干细胞必须在宿主的免疫系统处于免疫耐受状态时注入胚胎中，所以整个治疗时间表的灵活性低。在该方法中，除非进行全胚胎培养，否则难以得到有功能的人工肾前体，这就产生由于培养而引起污染的风险，并且在培养后需要进行复杂的纯化程序。
因此，存在对开发以下制备人工肾前体的方法的需要，所述方法中I)在移植至患者之前可容易地测试人工肾前体的生物安全性，2)操作简单，3)整个治疗时间表的灵活性可保证，以及4)不需要培养操作。
`[0006]现有技术文件
专利文件
专利文件1:W0 2008/004598
发明概述
技术问题
本发明的目标是提供制备人工肾前体的方法，其中I)在移植至患者之前可容易地测试人工肾前体的生物安全性，2)操作简单，3)整个治疗时间表的灵活性可保证，以及4)不需要培养操作。
解决问题的方案
为实现上述目标，本发明人进行了广泛的研究；结果，本发明人发现上述问题可通过使用以下人工肾前体解决，所述人工肾前体通过冷冻和解冻分离自胚胎的后肾，并将得自患者的间充质干细胞转移入解冻的后肾得到，从而开发出本发明。
因此，本发明涉及以下内容。
[I] 一种包含从生物体中分离出的非人类哺乳动物后肾的人工肾前体，其中所述后肾在生物体外已受到冷冻和解冻处理，并且包含在生物体外转移入的哺乳动物间充质干细胞。
[2] [I]中描述的人工肾前体，其中所述后肾为处于MHC表达仍未成熟时期的哺乳动物胚胎中的后肾。
[3] [I]中描述的人工肾前体，其中所述前体当移植入哺乳动物的网膜时能获得产生红细胞生成素的潜力。
[4] 一种制备人工肾前体的方法，其包括以下步骤:
(I)冷冻从生物体中分离出的哺乳动物后肾；
(II)解冻所述冷冻的哺乳动物后肾；以及
(III)在冷冻(I)之前或解冻(II)之后，在生物体外将哺乳动物间充质干细胞转移入后肾中。
[5] [4]中描述的方法，其中用于⑴中的后肾为从处于MHC表达仍未成熟时期的哺乳动物胚胎中分离出的后肾。
[6] [4]中描述的方法，其中所述人工肾前体在移植入哺乳动物的网膜时能获得产生红细胞生成素的潜力。
发明效果
利用本发明的方法，可在移植前容易地检测人工肾前体的生物安全性。利用本发明的方法，通过简单操作就有可能制备人工肾前体。利用本发明的方法，可灵活性地设计整个治疗时间表，因为通过使用冷冻保存的后肾可在所需时机制备人工肾前体。此外，因为本发明的方法基本避免 了对培养操作的需要，所以其并不包含污染的风险，也无需在培养后进行复杂的纯化程序。
实施方案的描述
本发明提供包含从生物体中分离出的哺乳动物后肾的人工肾前体，其中所述后肾在生物体外已受到冷冻和解冻处理，并且包含在生物体外转移入的哺乳动物间充质干细胞。
在本发明中，“人工肾”指的是非单个细胞的细胞组织，其具有产生红细胞生成素的潜力，这是肾天然具有的功能。本发明中的“人工肾”可能不具有过滤血液中的废料和水并排出尿的功能。除在其表面上的细胞之外，人工肾的各个细胞在三维上相互接触，相邻细胞通过各种胞间连接交换信息，并且可具有调节红细胞生成素产生的潜力。
“前体”指的是当置于生物体内时变成人工肾的组织。尽管“前体”具有产生红细胞生成素和调节红细胞生成素产生的潜力必需的因子，但是其处于由于环境因素而未显示产生红细胞生成素和调节红细胞生成素产生的潜力的状态。人工肾前体在移植至哺乳动物的网膜时能获得产生红细胞生成素的潜力。
“调节红细胞生成素产生的潜力”意指以下能力:当受体(患者)的身体需要比正常状态更大量的红细胞生成素时(贫血时等)，产生大量的红细胞生成素(对改善贫血所需的量)，以及在当受体(患者)处于正常状态时(贫血已改善时等)，产生对维持身体中的正常状态所需量的红细胞生成素。也就是说，本发明的人工肾比常规产生红细胞生成素的细胞更具优势，这是因为其能产生受体(患者)所需量的红细胞生成素，并且能通过从网膜的血管中获取必需营养而长时间连续产生红细胞生成素。[0031]在本发明中，“后肾”指的是在哺乳动物胚胎中对应于肾发生的部位。本发明中所用的后肾优选在开始发育前肾母细胞处于萌芽状态的后肾。后肾位于哺乳动物胚胎中的输尿管芽萌芽部位附近，更具体的是在体节和侧板之间。后肾优选为生后肾的中胚层。
作为从其中获得后肾的哺乳动物的实例，可指实验动物，例如啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠，以及兔；家畜，例如猪、牛、山羊、马、绵羊和水貂；伴侣动物(companionanimal)，例如狗和猫；灵长类，例如猴子、恒河猴、狨猴、猩猩和黑猩猩等。哺乳动物优选大鼠或猪。
后肾在生物体外从哺乳动物胚胎中分离出。就胚胎而言，其中MHC(主要组织相容性复合体)的表达仍未成熟的胚胎为适合使用的。通过使用处于该时期的后肾，可避免将人工肾前体移植至受体所伴随的免疫反应。当胚胎为非灵长类哺乳动物的胚胎时，优选在外源性抗原(糖链抗原例如α-Gal)出现前的时期内分离出后肾。例如，在使用大鼠的实验中，通常使用E(胚胎期天数)9-16、优选E10-15、更优选E11-14的胚胎。对于其它哺乳动物也一样，处于同等时期的胚胎可为适宜使用的。然而，只要条件为选定的，也可利用之前或之后的时期。可使用立体显微镜等进行从胚胎中分离后肾。
后肾的冷冻处理在常规用于冷冻哺乳动物组织或细胞的冷冻保存液中进行。冷冻保存液通常包含冷冻保护剂(cryopreservative)例如DMS0、甘油等。冷冻保护剂的浓度范围通常为5-30%重量，优选10-20%重量。保存液可包含血清。血清的浓度通常为5-50%重量，优选10-30%重量。作为优选的冷冻保存液，可指含DMSO和FCS的ET-KYOTO溶液、CELLBANKER (注册商标)等。
通过冷冻后肾，可抑制伴随着将人工肾前体移植至受体(患者)的免疫反应。
冷冻的后肾可以冷冻状态几乎永久地保存，并可根据需要在解冻和复苏后使用。冷冻保存期间的温度通常为-80°C至-200°C，优选_196°C (液氮中)。因为由于后肾的冷冻保存而可在所需时机制·备人工肾前体，所以可灵活性地设计整个治疗时间表。
根据常规方法，在生理培养基中使冷冻的后肾受到解冻处理。解冻的方法没有具体的限制；例如，随着冷冻管在37°C调温水浴中漂浮时，通过向其中以滴状加入生理培养基解冻冷冻的后肾。为了除去冷冻保存液污染物，优选将解冻的后肾用生理肉汤培养基洗涤。
本发明的人工肾前体中所用的后肾包含在生物体外转移入的哺乳动物间充质干细胞。
“间充质干细胞”广泛地意指以未分化状态增殖并能分化成成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞等中的全部或一些的干细胞或其祖细胞群体。用于本发明的间充质干细胞具有分化成产生红细胞生成素的肾细胞的潜力。
作为从其中获得间充质干细胞的哺乳动物的实例，可指实验动物，例如啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠，以及兔；家畜，例如猪、牛、山羊、马、绵羊和水貂；伴侣动物，例如狗和猫；灵长类，例如人、猴子、恒河猴、狨猴、猩猩和黑猩猩等。哺乳动物优选大鼠或人。
从其中获得间充质干细胞的哺乳动物优选与意图将本发明人工肾前体移植入的受体在动物种上相同的动物。更优选的是，使用受体自身的间充质干细胞。
间充质干细胞可通过公知的普通方法收集自哺乳动物骨髓液、外周血、脐带血等。例如，可通过培养和传代通过骨髓穿刺获得的造血干细胞等分离人间充质干细胞(Journalof Autoimmunity,30(2008) 163-171)。
分离自生物体的间充质干细胞还可通过在合适的培养基中进行粘附培养，在体外扩繁，同时保存其分化潜力。因此，间充质干细胞在体外的扩繁也落入本发明的范围内。就培养基而言，例如使用DMEM、EMEM、RPM1-1640, F_12、a -MEM、MSC生长培养基(BioWhittaker)等。培养温度通常为约30_40°C的范围内，优选约37°C。CO2浓度通常为约1-10%的范围内，优选约5%。湿度范围通常为约70-100%，优选约95-100%。为了维持高分化潜力，优选培养不延续超过2-5代以上。
将间充质干细胞转移入后肾中在冷冻后肾前或解冻后肾后进行。例如，将间充质干细胞在立体显微镜下使用微量吸液管等注入后肾中。转移入的细胞的数量根据后肾的大小等合适地确定；通常每个大鼠后肾注入约IO4-1O6个(例如，5X104个)间充质干细胞。
尽管悬浮于生理培养基中的间充质干细胞可用于转移，但是从防止在冷冻保存后的穿刺时漏出胞内液的观点看，适宜使用包封在含细胞外基质成分(层粘连蛋白、胶原IV型、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、Matrigel (注册商标)等)的凝胶中的间充质干细胞。
本发明人工肾前体的大小无需接近于肾(产生红细胞生成素的器官)的大小；整个肾大小的1/50至1/10为足够的。
本发明的人工肾前体可通过进行以下方法制备:
(I)冷冻从生物体中分离出的哺乳动物后肾；
(II)解冻所述冷冻的哺乳动物后肾；以及
(III)在冷冻⑴之前或解冻(II)之后，将哺乳动物间充质干细胞在生物体外转移入后肾中。
各个术语的定义和操作的细节如上所述。
尽管通过上述方法得到的本发明人工肾前体可经过器官培养，但优选不进行器官培养，因为这样没有污染的风险，并且在培养后无需进行复杂的纯化程序。本发明的人工肾前体的优势在于其在移植入哺乳动物时无需经过所述器官培养程序，就能获得足够的产生红细胞生成素和调节红细胞生成素产生的潜力。可通过将人工肾前体放置在过滤器上，向其下的皿中加入合适的培养基，并将所述皿静置于培养箱中，来进行器官培养。
当将本发明的人工肾前体移植至受体哺乳动物的体内时，该前体移入(engraft)受体体内，而且该前体中所含的间充质干细胞增殖并分化成产生红细胞生成素的肾细胞。因此，人工肾前体分化成具有产生红细胞生成素和调节红细胞生成素产生的潜力的人工肾，其立即能通过从血管中获取必要的营养而长时间连续地在生物体内产生红细胞生成素。因此，本发明的人工肾前体可用于治疗红细胞生成素相关疾病。通过将本发明的人工肾前体移植至哺乳动物，可治疗哺乳动物中的红细胞生成素相关疾病。
在本发明中，“红细胞生成素相关疾病”为与红细胞生成素产生的量减少有关的疾病，包括与肾衰竭、糖尿病、溃疡、癌症、感染、透析、外科手术或化学治疗有关的贫血。具体而言，在由于慢性肾衰竭产生的贫血的情况下，由于肾实质和肝功能的进行性破坏导致不能产生红细胞生成素，因而在循环中的红细胞生成素浓度不会上升；这是主要的问题。
作为受体哺乳动物的实例，可指实验动物，例如啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠，以及兔；家畜，例如猪、牛、山羊、马、绵羊和水貂；伴侣动物，例如狗和猫；灵长类，例如人、猴子、恒河猴、狨猴、猩猩和黑猩猩等。受体哺乳动物优选大鼠或人。
尽管将本发明的人工肾前体移植至哺乳动物中的方法没有具体的限制，只要该前体可移入受体体内并获得产生红细胞生成素和调节红细胞生成素产生的潜力即可，但是优选将人工肾前体移植至受体哺乳动物的网膜中。可通过普通手术方法移植至网膜中；例如，可指以下方法，其包括用锋利的钳状骨针夹起要被移植的组织，用钳状骨针尖端在网膜中的脂肪组织表面上切个小切口，并将组织植入切口内。本发明的人工肾前体还可借助于内窥镜移植入网膜内。
本发 明人工肾前体的剂量根据所给予的受试者、目标疾病、症状等而变化；一般而言，将制备自猪后肾的人工肾前体移植至成人肾性贫血患者(假定60kg体重)中时，在一次手术中移植约10个后肾并在监测患者贫血的严重程度时根据需要逐步增加后肾的数量，这都是合宜的。在其它动物的情况下，可移植根据60kg体重计算的量。
在下文中借助于以下实施例更详细地描述本发明，然而，不应以任何方式将本发明限制于以下实施例。
实施例
在怀孕14天时从大鼠胚胎中分离出后肾，然后在ET-Kyoto+10% DMS0+20% FCS中冷冻保存。直径为约2mm。
在冷冻保存2天后，将冷冻的后肾解冻。将大鼠间充质干细胞包封于Matrigel中，然后以IXio4个细胞/后肾注入后肾中。此后，将后肾移植至同系大鼠的网膜中。
移植7天后，将已成长的后肾从接受后肾移植的大鼠中分离出。接受后肾移植的动物数量为2，其中各自从7个后肾当中分别成长出3个和6个。后肾长成直径6-8mm。红细胞生成素在已生长的人工肾前体中的产生通过与Transplantation V0L85, Noll, June15 2008中所述方法一样的方法证实，即对产生红细胞生成素的细胞进行免疫染色和遗传分析。
工业实用性
利用本发明的方法，在移植前可容易地测试人工肾前体的生物安全性。利用本发明的方法，通过简单操作就有可能制备人工肾前体。利用本发明的方法，可灵活性地设计整个治疗时间表，因为通过使用冷冻保存的后肾可在所需时机制备人工肾前体。此外，因为本发明的方法基本避免了对培养操作的需求，其不牵涉污染的风险，也无需在培养后进行复杂的纯化程序。
本申请基于在日本申请的专利申请号2008-173935(申请日:2008年7月2日)，其内容通过本引用全文结合于本文中。
权利要求
1.一种包含从非人类哺乳动物胚胎的生物体中分离出的非人类哺乳动物后肾的人工肾前体，其中所述后肾在生物体外已受到冷冻和解冻处理，并且包含在所述胚胎的生物体外转移入的哺乳动物间充质干细胞。
2.权利要求
1的人工肾前体，其中所述后肾为处于MHC表达仍未成熟时期的非人类哺乳动物胚胎中的后肾。
3.权利要求
1的人工肾前体，其中所述前体在移植入哺乳动物的网膜时能获得产生红细胞生成素的潜力。
4.一种制备人工肾前体的方法，所述方法包括以下步骤: (I)冷冻从非人类哺乳动物胚胎的生物体中分离出的非人类哺乳动物后肾； (II)解冻所述冷冻的非人类哺乳动物后肾；以及 (III)在冷冻(I)之前或解冻(II)之后，在所述非人类哺乳动物胚胎的生物体外将哺乳动物间充质干细胞转移入后肾中。
5.权利要求
4的方法，其中(I)中所用的后肾为从处于MHC表达仍未成熟时期的非人类哺乳动物胚胎中分离出的后肾。
6.权利要求
4的方法，其中所述人工肾前体在移植入哺乳动物的网膜时能获得产生红细胞生成素的潜力。·
专利摘要
本发明公开了包含从生物体中取出的非人类哺乳动物后肾的人工肾前体，其中所述后肾在生物体外已受到冷冻和解冻处理，并且包含在生物体外转移入其中的哺乳动物间充质干细胞。
文档编号GKCN102105581 B发布类型授权 专利申请号CN 200980126125
公开日2013年9月4日 申请日期2009年7月2日
发明者小林英司, 横尾隆, 甲斐耕太郎 申请人:株式会社大塚制药工场, 学校法人自治医科大学, 学校法人慈惠大学, 学校法人东京女子医科大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (3),