专利名称:传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法。
背景技术：
i^MiWW^^i'MM (Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV) 属于虹彩病毒科(Iridoviridae)细胞肿大病毒属(Megalocytivirus) (Chinchar et al.， 2005)。何建国等Q001)测定了 ISKNV的全基因组序列(AF371960)，为首个被全基因组测定的肿大细胞病毒属病毒。ISKNV基因组大小约为1101Λ，具有胞嘧啶5’端高度甲基化，含有IM个开放读码框(ORFs)，其中有35个ORFs与其他种类的虹彩病毒在蛋白组成上有较为显著的同源性(He et al.，2001)。
ISKNV具有很强的传染性和致病性，目前尚无有效控制措施和药物，因此，建立有效的诊断系统，采取预防措施，消灭传染源，切断传播途径系当务之急。
目前，通过组织学和电镜观察进行检测，但此法操作繁琐，在其细胞肿大之前难以鉴定，而且检测误差较大，因为细胞肿大也可能是由别的原因引起的。公开号为 CN101624636的发明公开了一种传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法。该方法通过设计三对LAMP的引物BIP、FIP、B3、F3、LF、LB和一条探针FITC-Probe步骤，其中FIP为5， 端BIPO生物素标记引物，FITC-Probe为5，端FITC标记探针，配制含三对引物和样品模板的LAMP反应体系，对LAMP反应体系扩增，用探针杂交然后用LFD检测。该方法是将三对弓I 物在同一反应体系同时扩增，易产生引物二聚体，与目的基因不易分辨。而且LAMP方法也比较容易产生核酸污染，一旦开盖容易形成气溶胶污染(岳志芹等，2006)。
邓敏等Q002)以真鲷虹彩病毒(ISKNV)核苷酸还原酶小亚基(RNRS)序列为模板设计了一对引物，建立了一种ISKNV PCR检测方法。但由于只进行一轮PCR，所有该方法检测灵敏度较低，尤其是对患病早期的宿主的检测，同时一轮PCR的方法特异性也相对较低。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的引物，其序列为
外引物P1:TTACAGGATAGGGAAGCC
P2 :ATGTCTGCAATCTC AGGTGC
内引物P3 :ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAG
P4 :CGCGTCTACCTTAA TTTGCCC。
本发明的另一个目的是提供一种传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法，包括如下步骤以染病的宿主脾肾总DNA或细胞病变效应(Cytopathogenic effect, CPE)完全的敏感细胞系总DNA为模板，以标准品为阳性对照，用外引物Pl和P2先进行一轮PCR，再以第一轮PCR产物为模板，内引物P3和P4再进行一轮PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。[0012]所述染病濒死的宿主选自鳜鱼、大口黑鲈或者美国红鱼；所述敏感细胞系为Grimt fin (GF)。
所述第一轮PCR的反应体系为
DNA 模板 0. 5 μ 1，IOX 含 Mg2+ 的 PCR 缓冲液 2 μ 1，5pmol 的 dNTPs,所述引物 PU P2 各 15pmol, Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 补至 20 μ 1 ；
反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30s，46 57°C，优选为50°C退火30s， 72°C延伸lmin，30个循环，72°C延伸lOmin，10°C保温。
所述第二轮PCR的反应体系为
第一轮PCR 产物 0. 5 μ 1，IOX 含 Mg2+ 的 PCR 缓冲液 2 μ 1，5pmol 的 dNTPs，所述引物 P3、P4 各 15pmol, Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 补至 20 μ 1 ；
反应条件为94°C预变性:3min，94°C变性308，50 601退火308，721延伸lmin， 30个循环，72°C延伸lOmin，10°C保温。优选的反应条件为94°C预变性:3min，94°C变性30s， 55°C退火 30s，72°C延伸 lmin, 30 个循环，72°C延伸 lOmin，10°C保温。
本发明所检测的是传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白基因。
本发明的另一个目的是提供一种含有引物PI、P2、P3和P4的传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR检测试剂盒。所述试剂盒含包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、标准品和(MH2O。
所述标准品是携带以PI、P2为引物扩增得到的传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白基因片段的质粒。
本发明提供的方法发明建立的ISKNV Nest-PCR检测方法特异性强，与水生动物疱疹病毒、弹状病毒等无交叉反应；灵敏度高，检测限达到IO2个拷贝数，比普通PCR方法高 10 100倍；反应时间短，3小时左右即可得到检测结果，缩短了检测时间，而且所需仪器设备较为常见，操作较为方便，简单。
图1不同退火温度的第一轮PCR结果电泳图。
图2不同退火温度的第二轮PCR结果电泳图，CON 以ddH20为模板的阴性对照。
图3染病濒死鳜鱼脾肾组织总DNA的Nest-PCR结果。A^ P1/P2为引物的第一轮PCR结果，1 以ddH20为模板的阴性对照，2 以DNA为模板扩增目的基因；B 以P3/P4为引物的第二轮PCR结果，1 以ddH20为模板的阴性对照，2 4为一扩产物为模板的扩增结果。
图4 一轮PCR的检测极限，CON 以ddH20为模板的阴性对照，5 IO5拷贝数标准品模板，4 1依次类推。
图5两轮PCR的检测极限，阴性以ddH20为模板的阴性对照，9 IO9拷贝数标准品模板，8 1依次类推。
图6Nest_PCR交叉反应检测结果，阴性以ddH20为模板的阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1) IOOmg染病濒死鳜鱼脾肾组织，悬浮Iml IXPBS,冰上勻浆。
2)8000rpm，低温离心 lOmin。
3)上清放入离心管，加入500 μ 1 Tris饱和酚和500 μ 1氯仿:异戊醇(24 1)。混勻。
4)12000rpm，lOmin。
5)吸上清。注意不要吸中间层和下层，以免混入蛋白质污染。
6)加入十分之一体积NaAc，Iml无水乙醇，混勻，-20°C 30min。
7)12000rpm，lOmin。
8)弃上清，沉淀用70%乙醇洗两次，每次12000rpm，5min。
9)室温下，空气中晾至半干，50 μ 1水融解。
10)_20°C 保存备用。
实施例2
1) Iml CPE完全的GF细胞悬液，反复冻融3次。
2)8000rpm，低温离心 lOmin。
3)上清放入离心管，加入500 μ 1 Tris饱和酚和500 μ 1氯仿:异戊醇(24 1)。混勻。
4)12000rpm，lOmin。
5)吸上清。注意不要吸中间层和下层，以免混入蛋白质污染。
6)加入十分之一体积NaAc，Iml无水乙醇，混勻，-20°C 30min。
7)12000rpm，lOmin。
8)弃上清，沉淀用70%乙醇洗两次，每次12000rpm，5min。
9)室温下，空气中晾至半干，50 μ 1水融解。
10)_20°C 保存备用。
实施例3
1) IOOmg染病濒死美国红鱼脾肾组织，悬浮Iml IXPBS,冰上勻浆。
2)8000rpm，低温离心 lOmin。
3)上清放入离心管，加入500 μ 1 Tris饱和酚和500 μ 1氯仿:异戊醇(24 1)。混勻。
4)12000rpm，lOmin。
5)吸上清。注意不要吸中间层和下层，以免混入蛋白质污染。
6)加入十分之一体积NaAc，Iml无水乙醇，混勻，-20°C 30min。
7)12000rpm，lOmin。
8)弃上清，沉淀用70%乙醇洗两次，每次12000rpm，5min。
9)室温下，空气中晾至半干，50 μ 1水融解。
10)_20°C 保存备用。
实施例4[0065]Nest-PCR 的夕卜弓丨物 P 1 :5 ‘ TTACAGGATAGGGAAGCC 禾口 P2 5 ‘ ATGTCTGCAATCTCAGGTGC,内弓丨物 P3 :5 ‘ ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAG3，和 P4 5 ‘ CGCGTCTACCTTAATTTGCCC3’。
以制备的染病濒死鳜鱼的脾肾组织总DNA为模板，PCR体系为20 μ 1 =DNA模板 0. 5μ 1，含Mg2+的 10XPCR缓冲液2μ l，dNTP0. 5μ 1，引物(50pmol/y 1)各0. 3μ l，Taq DNA 聚合酶0. 5μ1，ddH20补足至20μ 1。反应条件为94°C预处理:3min，进行30个循环，每个循环反应包括 94°C 30s, (46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57) "C 30s, 72°C lmin，循环完成后，72°C充分延伸10min，10°C保温。
取0.5μ 1第一轮PCR产物作为模板，使用内引物P3/P4进行Nest-PCR扩增。内引物扩增时退火温度设置为50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,600C 10个温度，其他反应体系与反应条件与第一次扩增相同。取5μ 1反应液在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳观察。
结果表明，第一轮PCR在46 57°C退火温度范围内都可扩增出1400bp左右的目的条带，其中50°C条带最明显(图1)，目的条带通过测序确认。因此优选的外引物扩增的退火温度为50°C。第二轮PCR在50 60°C退火温度范围内都可扩增出600bp左右的目的条带，其中51°C附近非特异性扩增较明显(图2)，因此避开此温度区域，优选的内引物扩增的退火温度为55°C。
实施例5
以染病濒死的鳜鱼脾肾组织总DNA为模板，以P1/P2为引物进行第一轮PCR，退火温度为^°C，其他反应体系和反应条件同实施例1。取5 μ 1反应液在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳观察，检测到1400bp左右的条带(图3A)。取0. 5 μ 1第一轮PCR产物为模板，以Ρ3/ Ρ4为引物再进行一轮PCR，退火温度为55°C，其他反应体系和反应条件同实施例1。PCR结束后，取5μ 1反应液在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳观察，检测到600bp左右的条带(图:3B)。 表明该濒死的鳜鱼感染了传染性脾肾坏死病毒。
实施例6
1)以 TakaRa DNA Fragment Purification试剂盒对外引物 P1/P2PCR产物进行纯化回收。
2)将回收的目的基因与pGEM-T Easy Vector按摩尔比10 1混合，连接构建组质粒。连接体系(10 μ 1)如下[0074]10X ligation buffer1. 0μ 1[0075]pGEM-T Easy Vector1. 0μ 1[0076]PCR回收产物2. 0μ 1[0077]T4DNA连接酶1. 0μ 1[0078](MH2O5. 0μ 1[0079]充分混勻，16 °C过夜。[0080]3)将连接产物转化DH5 α感受态细胞，具体步骤如下
①从_80°C取出DH5a感受态细胞，室温迅速溶解后，立刻置于冰水上。
②取100 μ 1感受态细胞加于10 μ 1连接混合物中，轻轻吹吸混勻。
③静置冰水浴中，约30min。
④42°C水浴热击90s，立刻放于冰上冷却5min。[0085]⑤加900 μ 1 LB,置于 37°C温浴 60min。
⑥在含氨苄青霉素(lOOyg/ml)的LB平板表面均勻涂抹40 μ IIPTG和40 μ 1 X-gal贮存液，置于37°C培养箱。
⑦将温浴的感受态细胞，5000rpm离心3min，去上清，留约100 μ 1液体悬浮细菌， 均勻涂于LB/Amp/IPTG/X-gal平板上。
⑧37°C温箱倒置培养过夜。
4)测序鉴定
将单个阳性重组菌株接种于含Amp的LB液体培养液，37°C摇菌过夜，取1. Oml菌液于指管，密封，送上海生工测序检测。若目的基因成功连接，则相应阳性菌落摇菌过夜后， 以 TaKaRa MiniBESTPlasmid Purification Kit Ver 2. 0 试剂盒提取质粒，该质粒命名为 PGEM-T-S，作为阳性对照标准品备用。
实施例7
将阳性对照标准品(1014copy/ml)以10倍倍比稀释，分别以10°拷贝数、101、IO2、 IO3UO4UO5重组质粒标准品为模板进行PCR扩增，使用P3/P4为引物，扩增后取5μ 1反应液在0. 8%琼脂糖凝胶电泳观察。
经电泳检测，结果如图4所示。随着模板稀释倍数递增PCR产物的量逐级递减，模板稀释到IO4个拷贝数，目的基因条带很浅，模板稀释到IO3拷贝数PCR扩增结果则为阴性。
实施例8
将阳性对照标准品以10倍倍比稀释，分别以10°拷贝数、IO1UO2UO3UO4UO5UO^ IO7UO8UO9重组质粒标准品为模板进行Nest-PCR扩增，取5μ 1反应液在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳观察。
经电泳检测，结果如图5所示。随着模板稀释倍数递增PCR产物的量逐级递减，模板稀释到IO2个拷贝数，PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释到IO1拷贝数PCR扩增结果则为阴性。由此可得出Nest-PCR扩增能检测出100个拷贝数的病毒粒子，表明Nest-PCR的检测灵敏度比普通PCR方法高10 100倍。
实施例9
以中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus，STIV)、流行性造血
(Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV) > 1 |XM￠1 ^^f # (Tiger frog virus, TFV)、__f§[JBifilt§Jl(ifilSg__ (Viral Haemorrhagic Septicaemia virus，VHSV)、鲤春病毒(Springviraemia of carp virus, SVCV)、传染性胰脏坏死病毒 (Infectiouspancreatic necrosis, IPNV)、牙Sf ^单状病毒(hirame rhabdovirus, HRV) > 传染性造血器官坏死病毒infectious haematopoietic necrosis, IHNV)、斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus，CCV)、锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus，KHV)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleenand kidney necrosis virus, ISKNV)基因组为模板,进行 Nest-PCR检测，检测方法同实施例5。
电泳观察Nest-PCR扩增的结果，除ISKNV外，其他病毒则无特异性条带出现(图 6)。说明这种Nest-PCR检测方法可以特异性检测ISKNV。
序列说明
SEQ ID NO. 1 4 分别是引物 P1、P2、P3 禾口 P4。
权利要求
1.传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的引物，其序列为 外引物P1 :TTACAGGATAGGGAAGCCP2 :ATGTCTGCAATCTC AGGTGC 外引物P3 :ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAGP4 :CGCGTCTACCTTAA TTTGCCC。
2.传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法，其特征在于，以细胞病变效应完全的敏感细胞系总DNA为模板，以标准品为阳性对照，用权利要求
1所述外引物先进行一轮PCR，再以第一轮PCR产物为模板，用权利要求
1所述内引物再进行一轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
3.根据权利要求
2所述的检测方法，其特征在于，所述敏感细胞系为Gruntfin。
4.根据权利要求
2所述的检测方法，其特征在于，所述第一轮PCR的反应体系为 DNA模板0. 5 μ 1，IOX含Mg2+的PCR缓冲液2 μ 1，5pmol的dNTPs,权利要求
1所述引物 P1、P2 各 15pmol，Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 补至 20 μ 1 ；反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30s，46 57°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环，72°C延伸10min，10°C保温。
5.根据权利要求
4所述的检测方法，其特征在于，所述第一轮PCR的反应条件为94°C 预变性 3min, 94°C变性 30s, 50°C退火 30s, 72°C延伸 lmin, 30 个循环，72°C延伸 IOmin, 10°C 保温。
6.根据权利要求
2所述的检测方法，其特征在于，所述第二轮PCR的反应体系为 第一轮PCR产物0. 5 μ 1，IOX含Mg2+的PCR缓冲液2 μ 1，5pmol的dNTPs，权利要求
1所述引物 P3、P4 各 15pmol，Taq DNA 聚合酶 IU，ddH20 补至 20 μ 1 ；反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环，72°C延伸10min，10°C保温。
7.根据权利要求
6所述的检测方法，其特征在于，所述第二轮PCR的反应条件为94°C 预变性 3min, 94°C变性 30s, 55°C退火 30s, 72°C延伸 lmin, 30 个循环，72°C延伸 IOmin, 10°C 保温。
8.根据权利要求
2所述的检测方法，其特征在于，所述标准品为携带权利要求
1所述引物P1、P2的扩增产物的质粒。
9.含有权利要求
1所述引物的检测试剂盒。
10.根据权利要求
9所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、阳性对照标准品和ddH20。
专利摘要
本发明涉及一种传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法，该方法以染病的宿主脾肾或细胞病变效应完全的敏感细胞系总DNA为模板，以标准品为阳性对照，用外引物P1TTACAGGATAGGGAAGCC和P2ATGTCTGCAATCTCAGGTGC先进行一轮PCR，再以第一轮PCR产物为模板，用内引物P3ATGCTGGGCGCAAAGTAGTAG 和P4CGCGTCTACCTTAATTTGCCC再进行一轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。该方法检测特异性强，灵敏度度高，而且检测时间短，操作简单。
文档编号C12N15/11GKCN101956022 B发布类型授权 专利申请号CN 201010256267
公开日2011年12月28日 申请日期2010年8月17日
发明者张旻, 江育林 申请人:中国检验检疫科学研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1),