专利名称:一种酶法制备植物多肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备植物多肽的方法，尤其是涉及一种酶法制备植物多肽的方法。
背景技术：
植物蛋白包括谷类、豆类、坚果类来源的蛋白以及叶蛋白、单细胞蛋白等，对比动物蛋白，植物蛋白具有来源广泛，价格相对低廉，不含胆固醇等优点。中国人口众多，相对资源比较贫乏，所以开发植物蛋白产品更具有非常意义。但是植物蛋白在结构和特性上具有一些需要解决的缺陷。一、植物蛋白结构比较致密，植物蛋白通常是植物子叶或者果实的一部分，在结构中，往往被一些纤维素组织所覆盖或者包裹，这些都导致植物蛋白难以被人体所消化利用。二、植物蛋白往往分子量较大，所以植物蛋白溶解度较低、粘度较大，这些也都制约了植物蛋白应用领域的扩展。
利用生物蛋白酶对蛋白水解，改变蛋白质结构和性能，是工业上目前对蛋白质改性的一个重要途径。
植物多肽是植物蛋白在生物蛋白酶催化作用下得到的一种不完全水解产品，是植物蛋白水解产品的一种。现代营养学研究表明，对比蛋白质和氨基酸，多肽的吸收速度更快，吸收率更高，生物效价更高，同时，多肽还被证明具有多种生理活性功能，具有降胆固醇、降血压、抗氧化、能使人迅速恢复体力并提高耐力等保健功能，除此外，在应用特性上，多肽还具有高溶解度、酸溶性、低渗透压，高稳定性等应用特性。良好的性能，保证了产品具有广大的市场应用前景。[0005]近几年国内对植物多肽的研究和生产也非常重视，很多研究机构和企业大量开展了了植物多肽的生产和应用的研究工作，例如中国专利公开号CN1067226C披露了一种酶解大豆肽氨基酸口服液的方法。该法用1398蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种酶将大豆脱腥蛋白粉酶解，酶解料经静置沉降后，吸取上清液，经调味、过滤、真空包装、杀菌，制得大豆肽氨基酸口服液。该法属小试规模。CN1323535A专利以脱腥大豆蛋白制品为原料，用植物蛋白酶(试剂酶、木瓜蛋白酶、凤梨酶、脂肪蛋白酶)酶解，过滤，得到以小分子多肽为主的多肽和氨基酸混合液或经冷冻干燥大豆多肽和氨基酸混合粉末。CN1082345C披露的方法用脱脂大豆片为原料，经调浆，酸沉。再将酸沉淀凝乳调浆后，用胃蛋白酶水解，中和，喷雾干燥，得到大豆球蛋白含量低的大豆蛋白水解物。CN1175753C披露了一种无苦大豆多肽粉的生产方法。该法以大豆分离蛋白为原料，用中性蛋白酶和胰蛋白酶对大豆蛋白料液进行两次酶解，酶解液先用帆布过滤，在滤液中加入高岭土粉末，进行第一次吸附去苦处理，料液静置沉淀，虹吸吸出上清液。然后在分离出的清液中加入活性炭进行第二次去苦处理。将去苦后的酶解液真空浓缩，真空干燥，粉碎得到大豆多肽粉末。CN1183258C披露了一种大豆蛋白寡肽的生产方法，该法以大豆蛋白包括大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、脱脂大豆粉、大豆柏和豆饼为原料，先用Alcalase碱性蛋白酶再用酸性蛋白酶进行一次或者两次水解，得到富含小分子寡肽的酶解液。CN1935016A披露了一种高纯度、低分子量的大豆低聚肽的工业生产方法，该法以大豆分离蛋白为原料，先进行混合蛋白酶进行酶解，然后微滤和超滤结合的分离方法，对小分子多肽进行分离制备，产品得率达到35-55%。CN1559256A披露了一种大米多肽的制备方法，该法以大米渣为原料，加入α-淀粉酶和中性蛋白酶进行酶解，再进行过滤和喷雾干燥，得到制备得到的大米多肽产品；CN101297675A披露了一种小麦多肽的制备方法，该法以谷朊粉为原料，加入复合蛋白酶进行酶解，然后通过超滤膜技术对小分子多肽进行分离制备。
但是，在现有技术中，植物多肽制备遇到的第一个问题是植物蛋白结构紧密，糖蛋白含量也比较高，很难实现深度水解，单一考虑蛋白酶的因素，酶制剂加量过高，产品生产成本大大增加。或者有些工艺采用发酵方法，产品生产周期长，品质稳定性也难以得到保证；另一方面，当前植物多肽的生产厂家普遍采用超滤技术方法或者高岭土吸附等手段来分离大分子蛋白质，生产工艺复杂，投资大，另外产品的得率也较低。这些都制约了植物多肽生产和应用领域的进一步扩展。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种过程简单、消化率和吸收率较高、应用范围广泛的酶法制备植物多肽的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
(I)将植物来源蛋白和水混合，制成蛋白质浓度在Iwt % _20wt%的酶解底物，升温到40-65°C，并且调节溶液的pH为2-6 ；
(2)第一步酶解过程:加入酶解底物0.01_2被％的β-葡萄糖苷酶、0.01_2被％的植酸酶和0.01-8被％的蛋白酶，水解l-24h ；
(3)第二步酶解过程:将步`骤(2)得到的溶液的pH调节至6.5-9.5，控制温度为40-65°C，加入酶解底物0.1_8被％的蛋白酶，继续水解l-12h ；
(4)水解结束后，将得到的酶解液升温至80-90°C，保持15-45min灭酶，然后将pH调节至6-8，加入食品级蛋白质絮凝剂，在低速搅拌条件下絮凝沉淀l_3h，将经过絮凝处理的酶解液的温度降低至50°C以下，用离心机对酶解混合液进行分离，离心机转速为2500r/min-12500r/min，离心时间为10_50min，所得上清液为酶解肽液，沉淀物为非水溶性的非蛋白成分和未被酶解的蛋白成分；
(5)在0.3-0.5Mpa下用硅藻土为助滤对酶解肽液进行过滤精制，得到澄清水解液，用分子量小于200道尔顿的纳滤膜组对精制的酶液进行脱盐和浓缩，泵压力为
0.l_2MPa，料温25-60°C，反复水洗，直至电导率彡35us/cm2 ;同时调整使最终得到的肽液浓度为10-40%之间，脱盐后的肽溶液，经薄膜蒸发器浓缩，然后喷雾干燥，得到产品。
步骤(I)中所述的植物来源蛋白包括但不限于大豆蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆豆柏、花生柏或菜籽柏，所述的大豆蛋白粉包括但不限于脱脂大豆粉、大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白，所述的大米蛋白粉包括但不限于大米米渣、大米浓缩蛋白或大米分离蛋白。
步骤(2)中所述的葡萄糖苷酶、植酸酶及蛋白酶可以同时添加，也可以分步添加。[0017]步骤(2)中所述的β -葡萄糖苷酶包括商品化的β -葡萄糖苷酶或含有β -葡萄糖苷酶的复合酶。
步骤(2)中所述的植酸酶包括商品化的植酸酶或含有植酸酶的复合酶。
步骤⑵中所述的蛋白酶为可以在pH为2-6条件下作用的各种来源的蛋白酶，包括米曲霉、黑曲霉、宇佐美曲霉或里氏木霉等菌种发酵生产的酸性蛋白酶、动物来源的胃蛋白酶或基因手段改造得到的酸性蛋白酶。
步骤(3)中所述的蛋白酶为可以在pH6.5-9.0条件下作用的各种来源的蛋白酶，包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。
所述的碱性蛋白酶包括枯草芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶、动物来源的胰酶或基因工程手段改造得到的碱性蛋白酶。
所述的中性蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、杆菌来源的中性蛋白酶或基因工程手段改造得到的中性蛋白酶。
所述的复合蛋白酶包括Protamex蛋白酶。
步骤(4)中所述的蛋白质絮凝剂为可以用在食品加工中的蛋白质絮凝剂，包括单一絮凝剂和复合的絮凝剂。
步骤(4)中搅拌絮凝可以在灭酶结束后直接进行，也可以灭酶后先进行分离，去除不溶杂质，然后进行蛋白质絮凝，再进行第二次分离。
与现有技术相比，本发明过程简单，利用葡萄糖苷酶或含有葡萄糖苷酶的纤维素酶、植酸酶等酶系的作用，使蛋白质更多从原料中释放出来，降低了产品中的糖蛋白含量，从而也进一步提高了产品的消化性和吸收率，生产成本相对较低，投资较少，所得到的产品不仅可以直接作为保健品原料，也可以做为酸性植物蛋白饮料、清澈型饮料、运动食品、婴幼J L食品、车需食品、减肥食品、调味品的闻品质配料，也可以做为降血压药物及闻级化妆品的原料，具有广泛的应用前途。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
选用粉碎过的大米米渣(过100目)为原料，先将米渣在ρΗ5.0左右按照1: 6比例用80°C热水洗涤两次,然后加水混合配料,使最终配料浓度为20% (重量比,水分测定结果)；将PH调节至4.0，温度调节至50°C，加入0.5%的植酸酶、2%的酸性蛋白酶，实验反应6小时，然后将pH用20%的氢氧化钠溶液将pH调节至9.0，加入2%的Alcalase 2.4 (诺维信公司产品)，实验反应10小时，其中在第一个小时，系统持续调节pH，使pH保持在9.0左右。反应结束后，将酶解液pH调节至6.0，升温至85°C以上，保温15分钟灭酶；灭酶后按照体积比0.5 %加入配好的I %的甲壳素溶液，低速搅拌2小时；离心分离去除不溶组分，将清液用硅藻土过滤器过滤，得到的清液即为制备得到的多肽溶液。
实施例2
选用大豆分离蛋白为原料，加水混合配料，使最终配料浓度达到10% (重量比)，将pH调节至5.0，温度调节至55°C，然后加入0.4%的β -葡萄糖苷酶、1.5%的ProteaseM(天野公司产品)，实验反应6小时，然后将pH用20%的氢氧化钠溶液将pH调节至8.5，加入1.5%的胰酶，水解12小时，过程在第一小时控制pH，其后pH不作调整。反应结束后，将酶解液PH调节至6.0，升温至85°C以上，保温15分钟灭酶；灭酶后照体积比0.5%加入配好的I %的甲壳素溶液，低速搅拌2小时；离心分离去除不溶组分，将清液用硅藻土过滤器过滤，得到的清液即为制备得到的多肽溶液。
实施例3
选用粉碎的花生柏(过100目)为原料，加水混合配料，使最终浓度达到20% (重量比)，将pH调节至3.0，温度调节至55°C，然后加入1%的胃蛋白酶，水解6个小时，然后调节pH至5.0左右，加入0.5% β-葡萄糖苷酶、0.5%的植酸酶，水解5个小时，然后用20%NaOH溶液将pH调节至8.0,加入3%的Protamex复合蛋白酶(诺维信公司产品)，水解10个小时，过程不控制pH。反应结束后，将酶解液pH调节至6.0,升温至85°C以上，保温15分钟灭酶；灭酶后照体积比0.5%加入配好的I %的甲壳素溶液，低速搅拌2小时；离心分离去除不溶组分，将清液用板框过滤，得到的清液即为制备得到的多肽溶液。
实施例4
一种酶法制备植物多肽的方法，该方法包括以下步骤:
(I)将大豆蛋白粉和水混合，制成蛋白质浓度在Iwt %的酶解底物，升温到40°C，并且调节溶液的pH为6 ;
(2)第一步酶解过程:以酶解底物干基重量计算，加入酶解底物0.01wt%的商品化的β-葡萄糖苷酶、0.01被％商品化的植酸酶和0.01被(％的蛋白酶，水解111，其中β-葡萄糖苷酶、植酸酶 及蛋白酶同时添加，蛋白酶为可以在PH为2-6条件下作用的米曲霉发酵生产的酸性蛋白酶；
(3)第二步酶解过程:将步骤(2)得到的溶液的pH调节至6.5，控制温度为40°C，加入酶解底物0.^^%的蛋白酶，继续水解lh，蛋白酶为可以在pH6.5-9.0条件下作用枯草芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶；
(4)水解结束后,将得到的酶解液升温至80°C,反应45min灭酶，然后将pH调节至6，加入食品级蛋白质絮凝剂，在低速搅拌条件下絮凝沉淀13h，将经过絮凝处理的酶解液的温度降低至50°C以下，用离心机对酶解混合液进行分离，离心机转速为2500r/min，离心时间为50min，所得上清液为酶解肽液，沉淀物为非水溶性的非蛋白成分和未被酶解的蛋白成分；
(5)在0.3-0.5Mpa下用硅藻土为助滤对酶解肽液进行过滤精制，得到澄清水解液，用分子量小于200道尔顿的纳滤膜组对精制的酶液进行脱盐和浓缩，泵压力为0.1MPa,料温60°C，反复水洗，直至电导率< 35us/cm2 ;同时调整使最终得到的肽液浓度为10-40%之间，脱盐后的肽溶液，经薄膜蒸发器浓缩，然后喷雾干燥，得到产品。
实施例5
一种酶法制备植物多肽的方法，该方法包括以下步骤:
(I)将大米蛋白粉和水混合，制成蛋白质浓度在20wt%的酶解底物，升温到65°C，并且调节溶液的pH为6 ;
(2)第一步酶解过程:以酶解底物干基重量计算，依次加入酶解底物2wt%的含有β-葡萄糖苷酶的复合酶、2wt%的含有植酸酶的复合酶和8 〖％的蛋白酶，水解24h，其中蛋白酶为可以在pH为2-6条件下作用的动物来源的胃蛋白酶；[0045](3)第二步酶解过程:将步骤(2)得到的溶液的pH调节至9.5，控制温度为65°C，加入酶解底物8 1:%的Protamex蛋白酶,继续水解12h ；
(4)水解结束后，将得到的酶解液升温至90°C，反应15min灭酶，然后将pH调节至8，加入食品级蛋白质絮凝剂，在低速搅拌条件下絮凝沉淀lh，搅拌絮凝后进行离心分离，所得上清液为酶解肽液，最后采用板框过滤器、微滤或其他类似过滤装置进行过滤精制，从而得到澄清肽 液。
权利要求
1.一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (O将植物来源蛋白和水混合，制成蛋白质浓度在lwt%-20wt%的酶解底物，升温到40-650C，并且调节溶液的pH为2-6 ； (2)第一步酶解过程:加入酶解底物0.01-2wt%的β -葡萄糖苷酶、0.01-2wt%的植酸酶和0.01-8wt%的蛋白酶，水解l-24h ； (3)第二步酶解过程:将步骤(2)得到的溶液的pH调节至6.5-9.5，控制温度为40-65°C，加入酶解底物0.l-8wt%的蛋白酶，继续水解l_12h ； (4)水解结束后，将得到的酶解液升温至80-90°C，保持15-45min灭酶，然后将pH调节至6-8，加入食品级蛋白质絮凝剂，搅拌絮凝后进行离心分离，所得上清液为酶解肽液，最后采用板框过滤器对酶解肽液进行过滤精制得到澄清肽液，即为产品； 步骤(2)中所述的蛋白酶为可以在pH为2-6条件下作用的各种来源的蛋白酶，为米曲霉、黑曲霉、宇佐美曲霉或里氏木霉菌种发酵生产的酸性蛋白酶、动物来源的胃蛋白酶或基因手段改造得到的酸性蛋白酶； 步骤(3)中所述的蛋白酶为可以在pH6.5-9.0条件下作用的各种来源的蛋白酶，为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。
2.根据权利要求
1所述的一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的植物来源蛋白为大豆蛋白粉、小麦蛋白粉、大米蛋白粉、大豆豆柏、花生柏或菜籽柏，所述的大豆蛋白粉为脱脂大豆粉、大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白，所述的大米蛋白粉为大米米渣、大米浓缩蛋白或大米分离蛋白。
3.根据权利要求
1所述的一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的β -葡萄糖苷酶、植酸酶及蛋白酶同时添加或分步添加。
4.根据权利要求
1所述的一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的葡萄糖苷酶为商品化的葡萄糖苷酶。
5.根据权利要求
1所述的一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的植酸酶为商品化的植酸酶。
6.根据权利要求
1所述的一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，所述的碱性蛋白酶为枯草芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶、动物来源的胰酶或基因工程手段改造得到的碱性蛋白酶；所述的中性蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、杆菌来源的中性蛋白酶或基因工程手段改造得到的中性蛋白酶；所述的复合蛋白酶为Protamex蛋白酶。
7.根据权利要求
1所述的一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的蛋白质絮凝剂为可以用在食品加工中的蛋白质絮凝剂，为单一絮凝剂。
8.根据权利要求
1所述的一种酶法制备植物多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中搅拌絮凝在灭酶结束后直接进行或灭酶后先进行分离，去除不溶杂质，然后进行蛋白质絮凝，再进行第二次分离。
专利摘要
本发明涉及一种酶法制备植物多肽的方法，将植物来源蛋白和水混合后，再经过两步酶解过程，最后进行灭活并加入食品级蛋白质絮凝剂，搅拌絮凝后进行离心分离，所得上清液为酶解肽液，采用板框过滤器进行过滤精制得到澄清肽液，即为产品。与现有技术相比，本发明过程简单，利用β-葡萄糖苷酶或含有β-葡萄糖苷酶的纤维素酶、植酸酶等酶系的作用，使蛋白质更多从原料中释放出来，降低了产品中的糖蛋白含量，从而也进一步提高了产品的消化性和吸收率，生产成本相对较低，具有广泛的应用前途。
文档编号C12P21/06GKCN102115774 B发布类型授权 专利申请号CN 201010567162
公开日2013年7月10日 申请日期2010年11月30日
发明者赵黎明, 纪念 申请人:华东理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),