专利名称:一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用，具体是通过连续培养装置连续培养驯化选育得到的耐高浓度丁醇量和高溶剂产量的丙酮丁醇梭杆菌菌株，以及该菌株发酵丁醇工业中的应用，属于生物发酵技术领域：
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背景技术：
作为燃料，丁醇具有能量密度大，对水的稳定性高、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。丁醇又是重要的有机化工原料，广泛应用于油漆、表面涂料、皮革处理、塑料等领域。
丁醇的生产方法主要有乙醛缩合法，丙烯羰基合成法和发酵法。乙醛缩合法工艺流程长，收率低，成本较高，目前在国外已被淘汰；丙烯羰基合成法生产丁醇的原料为石化 下游产品丙烯；随着石油价格飞涨和资源加速枯竭，发酵法生产丁醇受到了广泛的重视，逐渐成为生物能源的研究热点之一。
近年来，国内对丙酮丁醇发酵的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、基因工程改造、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。丙酮丁醇工业发酵中溶剂对微生物细胞的毒性，是影响溶剂产量的一个关键限制因素。在所生产的丁醇、丙酮和乙醇三种溶剂中，丁醇是毒性最大的。当其浓度达到13 g/L (Journal of Proteome Research2010, 9:3046 3061),利用梭菌C. acetobutylicum发酵就基本停止,造成低丁醇产量和低底物转化率。据分析，如果丁醇发酵的产物浓度由12 g/L提高的19 g/L，产物分离的后续蒸馏成本将可降低一半(Curr Opin Biotechnol, 2008，19(5) : 420 429)。现有技术报道 Cbeijerinckii BAlOl在MP2培养基以及发酵调控条件下的丁醇产物浓度可达到20. 9 g/L(总溶剂为32. 6 g/L)，是目前报道的产溶剂最高的菌株。为了提高产溶剂梭菌本身的丁醇耐受性，Tomas 等(Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4951 4965)在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋白的#0万51基因，使丁醇对菌体细胞的抑制作用降低了 85%，并最终使产物浓度提高了 33%。Borden 等(Appl Environ Microbiol, 2007, 73(9): 3061 3068)在丙酮丁醇梭菌中过表达来源于基因组DNA文库中筛选过程中确定的2个与丁醇耐受性相关的基因，即可使重组菌体细胞的丁醇耐受水平分别提高了 13%和81%。中科院微生物研究院毛绍明等(Journal of Proteome Research2010, 9: 3046 3061)利用原生质体的方法以CZo1Striacetobutylicum DSM 1731为出发菌株筛选出一株能够耐受19 g/L 丁醇的突变株Rh8，通过发酵调控手段，单批发酵总溶剂产量为19.2 g/L。
可见，提高菌株的丁醇的耐受性是提高丙酮丁醇产量的重要手段之一，在丙酮-丁醇发酵工业中，起着至关重要的作用，而利用连续培养驯化菌种是提高丁醇耐受性，增强发酵竞争力的关键手段之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一株耐高浓度丁醇的丙酮丁醇梭菌{Clostridium aceteto),使其相对于现有技术的产丁醇的丙酮丁醇梭菌而言具有丁醇耐受性极强、总溶剂产量极高的优势。
本发明要解决的技术问题之二在于提供所述耐高浓度丁醇的丙酮丁醇梭菌{Clostridium acetobutylicum)的应用方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
一、本发明选育得到的一株丙酮丁醇梭杆菌菌株，分类命名为acetobutylicum BD 518，其保藏登记号为 CCTCC NO M 2010308。
本发明所述的高丁醇耐受丙酮丁醇梭菌ace tobu tyli cum BD 518的筛选方法是将丙酮丁醇梭菌出发菌株ace tobu tyli cum XY16 (CCTCC NO:M 2010011)经连续培养驯化后，利用丁醇平板筛选得到丁醇耐受强的菌株，再经厌氧瓶发酵筛选获得丁醇比高和总溶剂产量高的丙酮丁醇梭菌目标菌株，即命名为
acetobutylicum BD 518。
其具体的筛选步骤如下
a)连续培养驯化诱变将丙酮丁醇梭菌原始菌株CViostrit/iwffi acetobutylicumXY16 (CCTCC NO M 2010011)活化培养，即培养温度33 37°C，在25 mL的肖特厌氧瓶装液量为10 15 mL，培养时间12 18 h，得到处于对数生长期的菌液，接入含有新鲜培养基的自制连续培养装置中连续培养，接种量为5% 15%(v/v)。以葡萄糖为限制因子，在培养基中加入10 30mL/L正丁醇驯化600 1000 h，初步筛选到耐丁醇的丙酮丁醇梭菌菌株;
b) 丁醇平板初筛将连续培养装置(本发明人团队在先专利申请，专利申请公开号CN101709263A)中驯化筛选得到的菌液稀释至OD6tltl=O. I I. 0涂布于含丁醇I. 7%的培养基平板上，33 37°C厌氧培养12 36 h，挑选出10 50株单菌落；
c) 丁醇平板复筛将步骤b)筛选的菌株接种于25 mL的肖特厌氧瓶装液量10mL，充氮气2 min，33 37°C厌氧培养10 14 h，无菌生理盐水制成浓度OD=O. I的菌悬液，吸取2 UL点滴到含有丁醇I. 7%的常规固体培养基平板上，在33 37°C温度下厌氧培养12 24 h，挑选菌落较大的菌株；
d)厌氧瓶发酵筛选将步骤c)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33 37°C，厌氧培养培养时间10 24 h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5% 15% (v/V)，发酵温度33 37°C，厌氧发酵发酵时间60 80 h ;考察步骤c)筛选出的菌落发酵产总溶剂的量和溶剂中的丁醇比，同时选出丁醇比和总溶剂产量最高的目标菌株，即命名为Clostridium acetobu tylicum BD 518。
在上述筛选方法中步骤a)中所述的连续培养驯化方法中，优选限制因子葡萄糖浓度为10 30g/L，驯化时间为600 IOOOh0
在上述筛选方法中步骤b)和c)所采用的常规固体培养基、碳源为葡萄糖、淀粉中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。
在上述筛选方法中步骤d)所采用的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖中的一种或几种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素BI、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
二、本发明所述的ace tobu tyli cum BD 518在发酵生产丁醇中的应用。
具体的，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤
I)平板培养将丙酮丁醇梭菌BD 518接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33 37°C，培养时间12 24 h ;
2)种子培养将平板培养的丙酮丁醇梭菌ace tobu tyli cum BD 518接种到种子培养基中，培养温度33 37°C，100 mL厌氧瓶装液量40 60 mL，充氮气2 4min，培养温度33 37 °C,培养时间12 24h ；
3)发酵产丁醇将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为体积百分比5 15%，充氮气2 4 min，发酵温度33 37°C，发酵培养时间为60 80 h。
其中，本发明所述的平板培养基应理解为现有技术中任意适用于丙酮丁醇梭菌培养的常规平板培养基。例如，在本发明中所述平板培养基包含如下质量百分数的组分碳源
0.3% 1%、氮源0. 5% 1%、无机盐0. 5% 0. 8%、琼脂I. 5% 2%、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合。
本发明所述的种子培养基应理解为现有技术中任意适用于丁酮丁醇梭菌培养的常规种子培养基。例如本发明所述种子培养基包含如下质量百分数的组分碳源0. 5% 1%、氮源0. 5% 1%、无机盐0. 5% 0. 8%、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混
口 o
本发明所述的发酵培养基应理解为现有技术中任意适用于丁酮丁醇梭菌培养的常规发酵培养基。例如本发明所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分碳源4% 7%、氮源0. 1% 0. 3%、无机盐0. 1% 0. 2%、生长因子0. 05 0. 1%、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖和糖蜜中的一种或多种的混合；所述氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素BI、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
本发明的有益效果在于
本发明采用连续培养驯化筛选的丙酮丁醇梭菌，利用丁醇平板筛选出丁醇耐受强的菌株acetobutylicum BD 518,该菌株能高效地利用不同碳源发酵生产丁醇，丁醇耐受性强，糖的转化率高、总溶剂产量高、丁醇的比例高；在51发酵罐中，以葡萄糖为碳源，总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 21. lg/L和13. 2g/L，分别比出发菌提高了16. 6%和15. 8%，耐受性提高到18g/L，比出发菌株提高了 38. 5%，具有重大的社会意义和经济价值。
图I为丙酮丁醇梭菌连续培养驯化筛选的重要参数曲线。
本发明的微生物分类命名为丙酮丁醇梭菌命名为CViostrit/iwffi acetobutylicumBD 518，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2010年11月23 号，保藏编号为 CCTCC NO M 2010308。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求
书中所详细描述的本发明。
实施例I
本实施例说明本发明所述的ace tobu tyli cum BD518的筛选方法。
将丙酮丁醇梭菌CViostrit/i應acetobutylicum XY16原始菌株活化培养,培养温度37°C，50 mL肖特厌氧瓶装液量为15 20 mL，充氮气2 min，培养时间12 18 h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；接入装液量100 300 mL的自制连续培养装置中，接种量为5% 15%(v/v)，培养12 18 h后，流加含丁醇的新鲜培养基驯化选育。如附图I所示，随着丁醇浓度的不断增加，菌株的OD逐渐下降，总驯化时间为744 h。在驯化时间为472 h，600 h，700 h时分别取样，涂布平板，进行高丁醇耐受性突变株的筛选。
在筛选方法中，所使用的培养基配方(％为质量百分比)
(I)固体平板培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0. 2%，氯化钠0. 2%，七水合硫酸镁0. 3%，磷酸二氢钾0. 1%，磷酸氢二钾0. 1%，七水合硫酸亚铁0. 01%,琼脂 I. 5%，pH 6。
(2) 丁醇平板培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0. 2%，氯化钠0. 2%，七水合硫酸镁0. 3%，磷酸二氢钾0. 1%，磷酸氢二钾0. 1%，七水合硫酸亚铁0. 01%,琼脂 1.5%，丁醇 I. 7%, pH 6。
(3)种子培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0. 2%，氯化钠0. 2%，七水合硫酸镁0. 3%，磷酸二氢钾0. 1%，磷酸氢二钾0. 1%，七水合硫酸亚铁0. 01%, pH6。
(4)摇瓶发酵筛选培养基葡萄糖6%，乙酸铵0. 22%，磷酸二氢钾0. 05%,磷酸氢二钾0. 05%,氯化钠0. 001%,七水合硫酸镁0. 02%,七水合硫酸亚铁0. 001%, 一水合硫酸锰
0.001%,玉米浆 0. 1%，pH 6. 6。
筛选步骤
I、丁醇平板初筛
将连续培养装置中驯化筛选得到的菌液稀释至OD6tltl=O. I I. 0涂布于含丁醇
1.7%的培养基平板上，33 37°C厌氧培养12 36 h，挑选出50株单菌落。
2、丁醇平板复筛[0044]将筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶装液量10 mL,充氮气2 min, 33 37°C厌氧培养10 14 h，无菌生理盐水制成浓度OD=O. I的菌悬液，吸取2 UL点滴到含有丁醇
I.7%的常规固体培养基平板上，在33 37°C温度下厌氧培养12 24 h，挑选出生长好的的菌落；最终得到3株丁醇耐受性较高的菌株，分别为BD518，BD1202和BD2001。
3、摇瓶发酵筛选
将突变株BD518，BD1202，BD2001和原始菌株XY16接入种子培养基扩大培养，培养温度37°C，250 mL肖特厌氧瓶装液量100 mL，充氮气2 min，培养时间16 h。然后在发酵培养基中发酵，接种量10%(v/v)，发酵温度37°C，100 mL肖特厌氧瓶装液量50 mL，发酵时间72 h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表I所示
表I筛选培养基中BD518，BD1202, BD2001和原始菌发酵结果
权利要求
1.一株丙酮丁醇梭杆菌菌株，其分类命名为CViostrit/itt acetobutylicum BD 518,其保藏登记号为CCTCC NO M 2010308。
2.权利要求
I所述的acetobu tyli cum BD 518在发酵生产丁醇中的应用。
3.根据权利要求
2所述的应用，其特征在于具体应用步骤如下 .1)平板培养将acetobu tyli cum BD 518接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33 37 °C,培养时间12 24 h ; .2)种子培养将平板培养的acetobu tyli cum BD 518接种到种子培养基中，100 mL的厌氧瓶装液量40 60mL，充氮气2 4min，培养温度33 37で，培养时间.12 24 h ; .3)发酵产丁醇将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为体积比5 15%，充氮气.2 4min，发酵温度33 37°C，发酵培养时间为60 80 h。
4.根据权利要求
3所述的应用，其特征在于所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分碳源0. 3% 1%、氮源0. 5% 1%、无机盐0. 5% 0. 8%、琼脂I. 5% 2%、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、淀粉和纤维酸解糖液中的ー种或多种；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为こ酸铵和氯化铵中的ー种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的ー种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的ー种或多种。
5.根据权利要求
3所述的应用，其特征在于所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分碳源0. 5% 1%、氮源0. 5% 1%、无机盐0. 5% 0. 8%、其余为水；所述的碳源为淀粉和葡萄糖的ー种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为こ酸铵和氯化铵中的ー种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的ー种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的ー种或多种。
6.根据权利要求
3所述的应用，其特征在于所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分碳源4% 7%、氮源0. 1% 0. 3%、无机盐0. 1% 0. 2%、生长因子0. 05% 0. 1%、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木质纤维酸解糖液和木质纤维酶解糖液中的ー种或多种；所述的氮源为こ酸铵、氯化铵和酵母粉中的ー种或多种；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的ー种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素BI、生物素和玉米浆中的ー种或几种的混合。
专利摘要
本发明涉及一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用，属于生物发酵技术领域：
。本发明的丙酮丁醇梭杆菌菌株分类命名为ClostridiumacetobutylicumBD518，其保藏登记号为CCTCCNOM2010308。本发明通过连续培养驯化筛选得到一株高浓度丁醇耐受性菌株BD518，其丁醇耐受性达到了18g/L，比出发菌株(13g/L)提高了38.5%；以葡萄糖为碳源时，在5L发酵罐中总溶剂和丁醇产量分别达到21.1g/L和13.2g/L，分别比出发菌株提高了16.6%和15.8%；其丁醇耐受性强，溶剂产量高，重复性好，具有重大的社会意义和经济价值。
文档编号C12R1/145GKCN102226163 B发布类型授权 专利申请号CN 201110161533
公开日2012年8月29日 申请日期2011年6月16日
发明者吴昊, 姜岷, 杜腾飞, 欧阳平凯, 贺爱永, 郭亭, 陈可泉, 韦萍 申请人:南京工业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (1),