专利名称:一种测定三聚氰胺的dna标记的免疫传感器的构建方法
技术领域：
一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，属于免疫PCR领域。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine，MEL)俗称密胺、蛋白精，是一种三嗦类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。三聚氰胺对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。然而由于三聚氰胺具有很高的含氮量，食品工业常用凯氏定氮法测定氮总量来估算蛋白质的含量，因此三聚氰胺常被不法商人用作食品和饲料的添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标。2008年10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值:婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1.0mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg(L)。含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg(L)，高于以上限量值的产品一律不得销售。目前，用于三聚氰胺残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其需要复杂的样品前处理过程以及昂贵的检测费用。ELISA方法和免疫层析试纸条，所需检测时间相对短，但其检测限有限。因此，需要开发一种简单、快速、灵敏、经济的三聚氰胺检测方法。
基于抗原抗体反应的酶联免疫ELISA方法和免疫层析技术，分别以辣根过氧化物酶(HRP)和胶体金作为信号标记分子，受其灵敏度等的限制，检测含量有限。
实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是对DNA进行扩增的一种方法，同时可以精确灵敏的定量样品中极微量的DNA的含量。因此，基于RT-qPCR超强的扩增效应以及定量分析，以DNA作为检测的标记分子，可以带来更多的优势，如:检测限低、灵敏度高、特异性好、操作简单以及高通量分析等。
`[0005]抗原抗体免疫识别原理结合DNA的扩增分析，通过DNA扩增产生的荧光信号，间接测定待检目标物的含量。本方法的最大优点在于可以实现三聚氰胺飞克级的检测水平，是目前实现三聚氰胺检测灵敏度最高的一种方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA标记的免疫传感器，通过免疫识别和PT-qPCR的扩增与定量效应，通过DNA扩增产生的荧光信号对三聚氰胺进行间接检测。
本发明的技术方案:一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法,包括:DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺传感器的构建；具体步骤为:
(I) DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备
2.5mg双异功能团偶联剂4_(N_马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶解于200 μ L超纯水，取2 μ LSulfo-SMCC溶液用pH7.4含150mMNaCl的IOOmM PBS缓冲液稀释至200 μ L，然后取200 μ L 6mg/mL的三聚氰胺抗体与200 μ LSulfo-SMCC稀释液进行混合，使其终体积为400 μ L，于室温振荡反应30min，用截留分子量为3000的超滤管对反应物进行超滤，以除去多余的偶联剂；超滤截留物用含5mM EDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解并恢复其原体积400 μ L，取200 μ L上述溶解溶液用于下步反应；将200 μ L 4nmol 89bp的ssDNA加入到200 μ L的溶解溶液中，室温振荡反应30min，反应复合物用截留分子量50000的超滤管超滤，以除去未结合的DNA，此步骤超滤两次，以保证DNA被完全除去；最后截留物再用400μ 含5mM EDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解，得到偶联好的DNA-三聚氰胺抗体偶联物；
所述89bp 的 ssDNA 为:
5’ -SH-GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGTGAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC-3’ ；
(2)三聚氰胺包被抗原包被PCR管
首先将PCR管用50 μ L 0.8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超纯水将
PCR管洗涤三次，每次5min ;用50 μ L 8 μ g/mL的三聚氰胺包被抗原包被PCR管，在 37°C包被 2h，用 ρΗ7.2、含 0.05% Tween-20UOmM PBS 的 PBST 缓冲液洗涤，再用 ρΗ7.2、含0.4%明胶、IOmM PBS封闭缓冲液于37°C封闭2h，封闭结束后用上述PBST缓冲液洗涤干净；以上洗漆步骤均洗漆3次,每次3min ；
(3)三聚氰胺传感器的构建
在步骤(2)包被好的PCR管中，加入25yL 0.001pg/g 10pg/g的十倍梯度稀释的三聚氰胺标准品，再加入25 μ L步骤(I)合成的DNA-三聚氰胺抗体偶联物，在37°C反应30min后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，最后将PCR管拍打干净；
将上游引物和下游引物加入到SsoFast EvaGreen预混液中(购自南京润亚生物科技发展有限公司，南京市玉兰路86号)，使上游引物和下游引物的最终浓度均为20nM，将预混液充分混匀，每个PCR管中加入50 μ L含上游引物和下游引物的预混液,最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定。扩增条件为:首先95°C预变性30s，然后95°C变性5s、57°C退火和延伸30s，总共为39个循环；再从65°C升温至95°C，每0.5°C读取一次荧光值，得到DNA熔解曲线；
上游引物:5’ -GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT-3，，
下游引物:5’-GCCGAAAAATCTGGAAGGTC-3’。
所述三聚氰胺包被抗原的合成:将半抗原MEL-ACA (氨基己酸)采用混合酸酐法偶联到载体蛋白OVA上制备包被原。将20mg半抗原MEL-ACA加入ImL N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4°C下加入20 μ L三正丁胺和16 μ L氯甲酸异丁酯，在4°C搅拌下反应2h，得到A液；称取IOOmg OVA溶解在8mL硼酸盐缓冲溶液(0.2mol/L, pH9.0)中，为B液；在室温磁力搅拌下，将B液缓慢滴加到A液中，并在搅拌条件下继续反应3h，期间分两次共加入2mL的磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用0.0lmol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液透析3-4天，每天更换2次磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原:三聚氰胺-牛血清蛋白(此合成方法参照本申请人的专利申请:一种三聚氰胺人工抗原的合成方法，公开号为CN101402683A)。 透析结束后离心取上清，分装于0.5mL离心管中，置于_20°C保藏待用。[0021]所述三聚氰胺抗体的制备:将上述三聚氰胺-牛血清蛋白作为免疫原，与等量弗氏完全佐剂混合充分乳化后注射6-8周龄的雌性BALB/C小鼠，采取颈背部皮下多点注射，免疫剂量为100μ g/只，每间隔3周加强免疫一次，待血清效价达到要求后采用腹腔注射进行冲击免疫，冲免剂量为50 μ g/只；挑选出用于细胞融合的小鼠于融合前三天进行冲刺免疫，融合当天，无菌取出脾脏，制备脾细胞悬液并收集于50mL离心管内，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按5-10: I的比例混合于50mL融合管中，按照常规方法进行细胞融合，细胞用HAT培养液培养，96孔细胞培养板每孔100 μ L，置37°C 5%C02培养箱内培养；采用有限稀释法对筛选到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，将检测为阳性的细胞扩大培养或进行下一次亚克隆，连续进行三次亚克隆，且第三次亚克隆所有克隆孔均为阳性方可建立细胞株；选用健康的BALB/C小鼠，腹腔注射石蜡油，每只小鼠0.5mL, 7-10天后，腹腔接种用RPM1-1640基础液洗涤3次的杂交瘤细胞株，如腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧绷感时即可采集腹水，将采集的腹水12000rpm离心20min ;采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水的纯化，即得到纯化后的三聚氰胺单克隆抗体 ，置于-20°C备用。
本发明的有益效果:本发明提供了一种DNA标记的免疫传感器，通过免疫识别和PT-qPCR的扩增与定量效应，通过DNA扩增产生的荧光信号对三聚氰胺进行间接检测。
图1三聚氰胺标准曲线。
图2DNA-三聚氰胺抗体复合物中DNA扩增得到的扩增曲线。
图3扩增后的双链DNA熔解得到的熔解曲线。
具体实施方式
实施例1
( I) DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备
2.5mg双异功能团偶联剂4_(N_马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶解于200 μ L超纯水，取2 μ LSulfo-SMCC溶液用ρΗ7.4含150mMNaCl的IOOmM PBS缓冲液稀释至2 00 μ L，然后取200 μ L 6mg/mL的三聚氰胺抗体与上述稀释的200 μ L Sulfo-SMCC进行混合，使其终体积为400 μ L，于室温振荡反应30min，用截留分子量为3000的超滤管对反应物进行超滤，以除去多余的偶联剂；超滤截留物用含5mMEDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解并恢复其原体积400 μ L ;取200 μ L上述溶解溶液用于下步反应，将200 μ L 4nmol 89bp的ssDNA加入到200 μ L的溶解液中，室温振荡反应30min，反应复合物用截留分子量50000的超滤管进行超滤，以除去未结合的DNA，此步骤超滤两次，以保证DNA被完全除去；最后截留物再用400 μ L含5mM EDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解，得到偶联好的DNA-三聚氰胺抗体偶联物；
所述89bp 的 ssDNA 为:
5’ -SH-GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGTGAATGTAATG AACCTACAAG AC CTTCCAGA TTTTTCGGC-3’ ；
(2)三聚氰胺包被抗原包被PCR管
首先将PCR管用50 μ L 0.8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次5min ;用50 μ L 8μ g/mL的三聚氰胺包被抗原包被PCR管，在37°C包被2h，用 ρΗ7.2、含 0.05% Tween-20UOmM PBS 的 PBST 缓冲液洗涤，再用 ρΗ7.2、含 0.4% 明胶、IOmM PBS封闭缓冲液于37°C封闭2h，封闭结束后用上述PBST缓冲液洗涤干净；以上洗涤步骤均洗漆3次,每次3min ；
(3)三聚氰胺传感器的构建
在步骤(2)包被好的PCR管中，加入25yL 0.001pg/g 10pg/g的十倍梯度稀释的三聚氰胺标准品，再加入25 μ L步骤(I)合成的DNA-三聚氰胺抗体偶联物，在37°C反应30min后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，最后将PCR管拍打干净；
将上游引物和下游引物加入到SsoFast EvaGreen预混液中，使上游引物和下游引物的最终浓度均为20nM，将预混液充分混匀，每个PCR管中加入50 μ L含上游引物和下游引物的预混液，最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定。扩增条件为:首先95°C预变性30s，然后95°C变性5s、57°C退火和延伸30s，总共为39个循环；再从65°C升温至95°C，每0.5°C读取一次荧光值，得到DNA熔解曲线，用来验证DNA扩增的特异性；
上游引物:5’ -GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT-3，，
下游引物:5，-GCCGAAAAATCTGGAAGGTC-3，。
(4)检测灵敏度研究
根据RT-qPCR扩增得到的DNA扩增曲线，在扩增曲线的指数期选取合适的阈值，得到每个三聚氰胺浓度下对应的Ct值，以三聚氰胺的浓度为横坐标，Ct值为纵坐标做出一条标准曲线，根据标准曲线计算出三聚氰胺的检测限为0.3fg/g。
(5)特异性研究
以头孢菌素代替三聚氰胺作为检测目标物进行特异性研究，加入的头孢菌素的浓度和上述三聚氰胺的加入浓度相同，操作方法同三聚氰胺检测的操作方法一致，获得检测头孢菌素的DNA扩增曲线；所得每个头孢菌素浓度下的扩增曲线与未加入头孢菌素空白样的扩增曲线位于同一个位置，从而得出检测三聚氰胺的DNA-抗体偶联物没有识别头孢菌素，此方法的特异性良好。
(6)样品添加回收研究
将不含三聚氰胺的液态奶12000r/min离心20min,取上清液稀释两倍使用，分别添加0.001pg/g、0.01pg/g、0.lpg/g、0.5pg/g、lpg/g水平的三聚氰胺标准品，用此方法测定标准品的添加回收率，最终得到的回收率范围在104% 113%，可以用于实际样品的测定。
权利要求
1.一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，其特征在于包括:DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺免疫传感器的构建；具体步骤为: (1)DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备. 2.5mg双异功能团偶联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC溶解于200 μ L超纯水，取2 μ L Sulfo-SMCC溶液用ρΗ7.4含150mMNaCl的IOOmM PBS缓冲液稀释至200 μ L，然后取200 μ L 6mg/mL的三聚氰胺抗体与200 μ LSulfo-SMCC稀释液进行混合，使其终体积为400 μ L，于室温振荡反应30min，用截留分子量为3000的超滤管对反应物进行超滤，以除去多余的偶联剂；超滤截留物用含5mM EDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解并恢复其原体积400 μ L，取200 μ L上述超滤截留物的溶解溶液用于下步反应；将200 μ L 4nmol 89bp的ssDNA加入到200 μ L超滤截留物的溶解溶液中，室温振荡反应30min，反应复合物用截留分子量50000的超滤管超滤，以除去未结合的DNA，此步骤超滤两次，以保证DNA被完全除去；最后截留物再用400 μ L含5mM EDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解，得到偶联好的DNA-三聚氰胺抗体偶联物； 所述89bp的ssDNA为:
5’ -SH-GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGT GAATGTAATGAACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC-3’ ； (2)三聚氰胺包被抗原包被PCR管 首先将PCR管用50 μ L 0.8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次5min ;用50 μ L 8 μ g/mL的三聚氰胺包被抗原包被PCR管，在37°C包被2h，用ρΗ7.2、 含 0.05% Tween-20UOmM PBS 的 PBST 缓冲液洗涤，再用 pH7.2、含 0.4% 明胶、IOmMPBS封闭 缓冲液于37°C封闭2h，封闭结束后用上述PBST缓冲液洗涤干净；以上用上述PBST缓冲液洗漆的洗漆步骤均洗漆3次,每次3min ； (3)三聚氰胺传感器的构建 在步骤(2)包被好的PCR管中，加入25 μ L 0.001pg/g 10pg/g的十倍梯度稀释的三聚氰胺标准品，再加入25 μ L步骤(I)合成的DNA-三聚氰胺抗体偶联物，在37°C反应30min后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，最后将PCR管拍打干净； 将上游引物和下游引物加入到SsoFast EvaGreen预混液中，使上游引物和下游引物的最终浓度均为20nM，将预混液充分混匀，每个PCR管中加入50 μ L含上游引物和下游引物的预混液，最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定；扩增条件为:首先95°C预变性30s，然后95°C变性5s、57°C退火和延伸30s，总共为39个循环；再从65°C升温至95°C，每0.5°C读取一次荧光值，得到DNA熔解曲线； 上游引物:5 ’ -GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT-3，， 下游引物:5 ’ -GCCGAAAAATCTGGAAGGTC-3’。
专利摘要
一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，属于免疫PCR领域。本发明包括DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺免疫传感器的构建。本发明提供一种DNA-三聚氰胺抗体偶联物，经过免疫识别与DNA的荧光定量PCR扩增，通过扩增后的荧光信号对三聚氰胺进行检测。本发明方法能实现对三聚氰胺超灵敏检测，检测限低、检测灵敏度高、特异性好，为痕量三聚氰胺药物的检测提供了一种有效的方法。
文档编号C12Q1/68GKCN102827934 B发布类型授权 专利申请号CN 201210309464
公开日2013年7月17日 申请日期2012年8月28日
发明者胥传来, 尹红红, 徐丽广, 王利兵, 匡华 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan