专利名称:水中大肠菌群快检纸片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水中大肠菌群快检纸片，是一种专门用于水中快速检测大肠菌群的鉴定试剂。其主要成分是蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、乳糖、琼脂、胆盐、硫代硫酸钠、40g/L溴甲酚紫溶液、20g/L TTC溶液、蒸馏水，按比例混合后经灭菌浸渍于层析滤纸上，在无菌条件下恒温烘干，每份包括5袋吸附10mL水样的大纸片(11×11cm2)和10袋吸附1mL水样小纸片(5×5cm2)。分别装于五联的聚丙烯塑膜袋内，再密封于铝箔袋内，10℃以下保存备用。水中大肠菌群快检纸片可用于饮用水、水源水、地表水、废水、污水等水中大肠菌群或粪大肠菌群的检测。
背景技术：
大肠菌群是人畜粪便中的主要细菌，因而被用来作为反映水中是否被粪便污染或污染程度的指示菌。大肠菌群数的高低，表明了水质被粪便污染的程度，故以此作为粪便污染指标来评价被测水的卫生质量，推断水中有否污染肠道致病菌的可能。目前大肠菌群作为评价水质卫生质量的主要指标之一，已被国内外广泛应用。我国已将其纳入“国家标准”和“水质检验规范”。检测大肠菌群传统的方法是试管发酵法和滤膜法，需要配制新鲜培养基，操作方法及步骤繁琐，成本价格高，检测时间长，达不到快速一步法，大肠菌群的检测结果无法定量分析；不含有中和剂，在检测中易受干扰因素影响等缺点。因此，业内一直希望能有一种经济、简便、易行、快速、准确的方法和产品。
本发明的目的在于提供一种能克服已有方法和产品不足的专用于水质快速检测大肠菌群的鉴定试剂。具有可适合于各种场合水质的大肠菌群的培养检测，操作方法简便、易行、快速(一步法)，特异性强，敏感性高，结果准确，成本低廉，便于基层单位特别是边沿地区及条件差的实验室使用。产品中含有中和剂，在检测中不易受样品化学因素影响，省去了样品处理中加中和剂的繁琐；产品中含有抑菌剂，减少了非大肠菌群细菌的干扰。
发明内容本发明的要点在于选择反应结果最佳的组分配方和适当的载体纸片，并进行一系列合理的溶解、校正pH、灭菌、浸渍纸片、恒温烘干、无菌包装于恰当的容器等工艺流程，而制成一种专业的大肠菌群快检纸片。
本发明选择的配方如下(组分及其每升含量)蛋白胨20～30g；氯化钠3～5g；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)8～12g；乳糖15～20g；琼脂1～2g；胆盐1～2g；硫代硫酸钠3～5g；40g/L溴甲酚紫酒精溶液4～5mL；20g/L红四氮唑(TTC)溶液5～7mL；蒸馏水1000mL。
蛋白胨作为细菌的氮源，为培养大肠菌群提供其生长所需要的营养和能量，同时作为作用底物被分解脱氢；氯化钠为培养大肠菌群提供其生长所需要的渗透压；磷酸氢二钾为具有一定缓冲作用的碱式盐，用于调节培养基的pH值，并保持其相对的稳定；乳糖作为细菌的碳源，为培养大肠菌群提供其生长所需要的新陈代谢的能源，同时作为大肠菌群细菌的作用底物可被分解而产酸产气；琼脂作为培养基的赋形剂，溶解冷却后可将培养基中的有效成分固定于载体纸片上；胆盐是一种抑菌剂，可抑制革兰氏阳性菌等非大肠菌群细菌的生长，以减少生物干扰因素；硫代硫酸钠作为中和剂，其作用是中和祛除水样残留的干扰因素(如余氯等)；溴甲酚紫溶液为酸碱指示剂，大肠菌群细菌分解乳糖产酸可使之变黄，TTC溶液为氧化还原指示剂，细菌作用底物所产氢与之发生反应形成不可逆的红色化合物。利用大肠菌群细菌能分解乳糖产酸使纸片变黄、分解底物所产氢与TTC结合在纸片上形成红色斑点或红晕状来鉴别大肠菌群是否生存，从而推导被测水的卫生质量。
本发明产品的制备方法
1)载体纸片将新华层析滤纸，切成5cm×5cm和11cm×11cm规格，经干烤或高压灭菌(高压后于45℃温箱烘干)后备用；2)内包装袋将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按实验要求压合成一定规格的5联袋，其中一种规格为6.5×9cm，一种规格为12.5×19cm，100℃15min蒸汽灭菌后于45℃烘干备用。
3)制备培养基将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、乳糖、琼脂、胆盐、硫代硫酸钠、蒸留水按比例混合加热溶解，冷后调pH7.0～7.4，再按量加入40g/L溴甲酚紫溶液，混匀，115℃15min高压灭菌，冷至60℃左右按量加入过滤除菌的20g/L TTC溶液，混匀。
4)浸渍纸片将空白纸片排放于灭菌的深搪瓷盘内，加入40℃左右的培养基使之淹没纸片，浸泡数分钟，使培养基充分吸附于纸片，挤去多余的培养基，摆放于无菌不锈钢丝网上，45℃恒温室烘干。
5)包装将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中1套12.5×19cm的5联袋装11cm×11cm的纸片，每袋2张，2套6.5×9cm的5联袋装5cm×5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铂袋，封口后10℃以下保存备用。
本发明具有以下优点1)大肠菌群快检纸片适合于饮用水、水源水、地表水、废水、污水等各种水质中大肠菌群的培养检测。2)成本低廉。3)操作方法简便易行，检测步骤简捷快速，检测时间只需18～20h，比常规发酵法缩短了4天，使繁琐的发酵培养和证实试验技术简化到一步法即可完成，一般人员都能掌握操作。4)产品的敏感性高、特异性强、结果准确，与国标方法符合率高。5)纸片有一定的规格，大肠菌群可均匀分布于纸片，在表面形成鲜明的菌落特征，使大肠菌群的检测达到快速准确定量分析。6)大肠菌群快检纸片含有中和剂和抑菌剂，在检测中可消除或减少化学因素和生物因素的干扰影响。7)产品附有详细使用说明书和“大肠菌群最可能数(MPN)检索表”，按此要求进行，即可完成全部操作过程，直接报告检测结果，方便现场使用。
具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，按照下表所列数据(每升含量)及其所述步骤进行配置配方一
配方二
配方三
各配方均按上述本发明产品制备方法进行。使用时按下列步骤操作1.将产品外包装剪开，在5袋大纸片接种原样品每袋10ml，5袋小纸片接种原样品每袋1ml，另5袋小纸片接种1∶10稀释样品每袋1ml；如为饮用水，也可只接种5袋大纸片，每袋10mL；如为污染较严重的水样，估计大肠菌群含量较多，可于5袋小纸片接种原样品每袋1ml，5袋小纸片接种1∶10稀释样品每袋1ml；5袋小纸片接种1∶100稀释样品每袋1ml。封闭袋口保湿，于37℃培养18～20h观察结果。
2.结果判定纸片保持青紫色为阴性；出现红(或橙)色斑点且周围变黄色为阳性。根据各不同接种量的阳性袋数，查相应MPN检索表，报告检测结果。
权利要求
1一种水中大肠菌群快检纸片，是以乳糖蛋白胨培养基为基础液，硫代硫酸钠为中和剂，胆盐为抑菌剂，溴甲酚紫、TTC为指示剂，层析滤纸为载体，经一系列溶解、校正pH、高温灭菌、加指示剂、浸渍纸片、恒温烘干、无菌包装等工艺流程而制成的一种专业的大肠菌群快检纸片。其特征在于具有如下配方(组分及其每升含量)蛋白胨20～30g；氯化钠3～5g；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)8～12g；乳糖15～20g；琼脂1～2g；胆盐1～2g；硫代硫酸钠3～5g；40g/L溴甲酚紫酒精溶液4～5mL；20g/L红四氮唑(TTC)溶液5～7mL；蒸馏水1000mL。
2根据权利要求
1所述，水中大肠菌群快检纸片的制备方法，其特征在于具有如下的步骤2.1载体纸片将新华层析滤纸，切成5cm×5cm和11cm×11cm规格，经干烤或高压灭菌(高压后于45℃温箱烘干)后备用；2.2内包装袋将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按实验要求压合成一定规格的5联袋，其中一种规格为6.5×9cm，一种规格为12.5×19cm，100℃15min蒸汽灭菌后于45℃烘干备用。2.3制备培养基将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、乳糖、琼脂、胆盐、硫代硫酸钠、蒸馏水按比例混合加热溶解，冷后调pH7.0～7.4，再按量加入40g/L溴甲酚紫溶液，混匀，115℃15min高压灭菌，冷至60℃左右按量加入过滤除菌的20g/L TTC溶液，混匀。2.4浸渍纸片将空白纸片排放于灭菌的深搪瓷盘内，加入40℃左右的培养基使之淹没纸片，浸泡数分钟，使培养基充分吸附于纸片，挤去多余的培养基，摆放于无菌不锈钢丝网上，45℃恒温室烘干。2.5包装将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中1套12.5×19cm的5联袋装11cm×11cm的纸片，每袋2张，2套6.5×9cm的5联袋装5cm×5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铂袋，封口后10℃以下保存备用。
3水中大肠菌群快检纸片使用说明格式及其内容。
专利摘要
本发明“水中大肠菌群快检纸片”，是一种专门用于各种类型水中大肠菌群的快速检测试剂。通过对主要成分及其用量的合理配伍、加入抑菌剂，减少生物因素的干扰，科学的工艺制备方法和适宜的包装形成商品化产品，有55.5mL和5.55mL两种规格。该试剂及其实际检测成本低廉，操作简捷快速，使试管法发酵的培养和证实试验技术简化到一步法即可完成；其方法敏感性好、特异性强、干扰因素少、结果准确，与国标方法符合率高，可使水中大肠菌群的检测达到定量分析。适用于饮用水、水源水、地表水、废水、污水等各种水质中大肠菌群的快速检测。
文档编号C12Q1/10GK1995375SQ200610069664
公开日2007年7月11日 申请日期2006年8月7日
发明者马乐好, 阚方琦, 王方木 申请人:山东省疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan