专利名称:胶原酶制备工艺的制作方法
本发明属酶工程或生物工程技术领域：
。
胶原酶(Collagenase)是一种在生理PH及温度条件下水解天然胶原蛋白酶，胶原酶不仅是细胞分离的重要工具酶，而且是外用清疮脱痂，局部注射治疗椎脊盘突出症的良好药物。
1927年Ssadilow首先使用了“Collagenase”的名称，1938年Grassmenn第一次证明胶原酶的存在，它能作用于天然胶原分子的特异性螺旋体结构部份，通过对各种菌产生胶原酶的研究，认为只有溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridum histolyticum)与介毒无色杆菌(Achro-mobacter iophagus)较有价值，在胶原酶的制备方面，美国哥伦比亚大学I.mandl博士提出的发酵配方提取方法及检定方法至今仍为各国研究工作者采用。五十年代提纯胶原酶的方法有四类(1)硫酸铵沉淀法(2)有机溶剂沉淀分离法，(3)电泳法(4)吸附洗脱法。1959年，Grant.N.H.Alburn，H.z报导使用DEAE离子交换层析精制胶原酶的方法，七十年代至今采用的方法主要有两类(一)利用各种交换材料及分子筛进一步分离提纯胶原酶(二)用亲和层析提纯胶原酶。
原工艺路线长，发酵液配方复杂。
本发明为了提高胶原酶的质量，改进了发酵液配方，改进了提取精制方法，提高收率。
本发明制备工艺为1.菌种Cl.histolyticum 64008。
2.培养基配方酵母膏0.2-1%，酵母粉0.2-1%，明胶1%-3%，肉胨2%-6%。
3.发酵液培养温度37℃-42℃，周期为40-45小时，静止发酵。
4.发酵液经无菌过滤后，在10℃以下，加硫酸铵沉淀胶原酶，使浓度达到45-55%(重量/体积)所获沉淀溶于PH7-8，Tris-Ca++缓冲液在低温与氮气加压下经超滤膜脱盐，冷冻干燥获胶原酶粗品。
5.胶原酶粗品经以PH5-6，HAC-NaAC缓冲液平衡之DEAE纤维素柱层析，下柱液再经PH6.0-7.5电导水平衡的SephadexG-25柱，获得溶液经冰冷干燥即为胶原酶精制品，活力达到800-1000单位/毫克蛋白质。
实施例1、菌种组织梭菌Cl.histolyticum64008一级种液酵母膏0.2%-1.0%，牛肉膏1%-2%，肉胨2%-6%，明胶1%-3%;二级种液酵母膏0.2%-1.0%肉胨2%-6%，明胶1%-3%;接种量3%-5%，培养温度37℃-42℃，周期24小时，发酵液酵母膏0.2%-1%，酵母粉0.2%-1%，明胶1%-3%，肉胨2%-6%，PH7-8，温度37℃-42℃，周期40-45小时，静止发酵，发酵液效价在400单位/毫克，毒性安全剂量小白鼠尾静脉注射50单位/只。发酵液经无菌过滤，泵压至盐水冷却锅，在低温下加入硫酸铵使达50%浓度(重量/体积)，再加入1%氯化钙，放置过夜，收集硫酸铵沉淀，溶解于0.05克分子/Tris-Ca++缓冲液，离心除杂质收集粗酶液，以超滤膜脱盐，无菌过滤，冷冻干燥，得胶原酶粗品，较发酵液的比活力提高5-10倍，酶活性收率为50%。
例2以PH5-6的醋酸缓冲液平衡DEAE-Cellulose装柱3.6×50厘米柱，进样量控制在30万-50万单位，粗酶溶于醋酸缓冲液，上柱，收集胶原酶部份，再上Sephadex G-25柱(3.6×50厘米)，以NaCL，NaoH调节水使电导达40-70微欧-1，收集胶原酶部份，冷冰干燥，所获得胶原酶精品纯度可达800-1000单位/毫克蛋白质，每1200胶原酶单位中，蛋白酶含量低于10单位。
按本工艺制得的胶原酶，产品质量符合要求，制备的胶原酶试剂可供各研究单位分离细胞用，制备药理规格的外用油膏制剂可用于治疗清疮脱痂，制备的注射剂可用于治疗椎脊盘突出症。
权利要求
1.一种利用组织梭菌Cl，histolgticum64008经培养发酵后再经DEAE纤维素及分子筛分离提纯胶原酶的工艺，本发明的特征在于将菌种经组份为酵母膏0.2-1%，酵母粉0.2-1%，明胶1-3%，肉胨2-6%的培养基在温度为37-42℃，周期40-45小时静止发酵后，无菌过滤，在10℃以下加硫酸铵沉淀胶原酶，使浓度达到45-55%(重量/体积)，所获沉淀溶于PH7-8Tris-Ca++缓冲液在低温与氮气加压下经招滤膜脱盐，冷冻干燥获胶原酶粗品，然后经以PH5-6，HAC-NaAc缓冲液平衡之DEAE纤维素柱层析，下柱液再经PH6.0-7.5电导水平衡的SephadexG-25粒，得到溶液经冷冻干燥即为胶原酶精品。
专利摘要
本发明属于酶工程或生物工程的技术领域：
。胶原酶是一种在生理pH及温度条件下水解天然胶原酶的水解蛋白酶，我们将组织梭菌Cl·histolyticum64008经改进的培养基、发酵液静止发酵得到毒性低的胶原酶，将发酵液经过无菌过滤，硫酸铵沉淀、脱盐、冻干获得胶原酶粗品，再经DEAE柱层析及Sephadex G-25脱盐，冻干后可得精品，该胶原酶是细胞分离的重要工具酶，其油膏制剂用于治疗清疮脱痂，其注射用于治疗椎脊盘突出症
文档编号C12N9/54GK85103913SQ85103913
公开日1986年12月24日 申请日期1985年6月19日
发明者卞祖宁, 于保贞, 王若驹, 张蓓蕾, 许海宝, 孙忆华 申请人:国家医药管理局上海医药工业研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan