专利名称:利用运动发酵单胞菌细菌由蔗糖生产乙醇的制作方法
本项发明是关于利用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的高活力菌株，在微氧条件下使得蔗糖一步发酵产生乙醇的方法。
传统的乙醇发酵方法是利用酵母菌经过两步发酵完成，其第一步包括酵母细胞的好气性增殖称为生长阶段;第二步包括在少氧或缺氧条件下嫌气发酵产生乙醇。为了在第二步能进一步增殖酵母细胞，需要加入少量空气或氧气。如果要提高总发酵效率加入少量空气或氧气是需要的，也可通过沉淀和离心系统偶而地再循环利用酵母细胞来提高。由于酵母发酵恒定地取决于菌体生长与产乙醇率两个因素的配合，为了使乙醇生产最合适，其培养液中则必须添加能促进生长的物质或能完善地控制通气条件。
因此，传统的酵母发酵法(阶段2)取决于巨大的接种量，每毫升接种量几乎达5-10百万个细胞。最适宜的发酵温度是30℃，发酵产生的热量必须通过冷却设备来控制。在发酵时间中要得到9-11%(体积比)乙醇，则批量发酵第二阶段所要时间是30-70小时。通过菌体循环使用以提高接种菌密度80-100倍时，则这个发酵时间能减少到10小时。
第二个生产乙醇的方法是大家熟知的利用运动发酵单胞菌细菌发酵产生乙醇(参见欧洲专利号0047641-George Weston Ltd.)。这个方法也是一个如上所述的酵母两步发酵法，但细菌在生长阶段(阶段1)不需要增加空气。代之以增加适量氮气来维持厌气条件。在产生乙醇的第二阶段中，糖的浓度决不能超过6%(重量/体积)，这就需要分步地、或流加浓缩的糖液。发酵温度最好是28℃-33℃。适宜的pH是约5.5。这一方法也需要提供氮气和额外的营养物质。
第三个乙醇生产方法，已叙述过，它是在两阶段发酵中利用固定化酵母或固定化发酵单胞菌属(Zymomonas)的菌株，每步需要用限量的糖(即10%重量/体积)。(参见英国专利号2055121-Tanabe Sngaku Co.Ltd.)。
在用酵母发酵的实例中，转换碳源已知可用蔗糖、葡萄糖、糖蜜和和甘蔗汁;在利用发酵单胞菌的两步发酵的实例中，碳源限定为葡萄糖;在用固定化细胞的发酵法中，则限定是葡萄糖和糖蜜。
本发明的目的在于提供一种利用运动发酵单胞菌细菌，从蔗糖一步发酵产生乙醇的方法。
本发明的理想目的在于提供一种这样的一步批量发酵法，或如有需要，调整这个培养方法，如批量供给，连续供给或多步供给系统使放入的能源低。
本发明进一步的理想目的在于提供一种方法，其中蔗糖的质量对方法不是必需的因素。
本发明的一个方面在于是一种从蔗糖(或它的水解产物或转化糖)发酵产生乙醇的方法，其特征是利用了微生物运动发酵单胞菌发酵蔗糖，在微氧条件下一步发酵产生乙醇，其中蔗糖包含在发酵培养液中。
在说明书和权利要求
书中，所有“蔗糖”这一术语也包括它的水解产物和转化糖。
“一步发酵”是指在发酵中，细胞生长和产乙醇阶段在同一发酵罐中完成。发酵起始可用含有运动发酵单胞菌的种子培养液加到含有培养基的发酵罐中，或把发酵培养基加到含有一部分前发酵培养液的发酵罐中而完成。前发酵培养液含有运动发酵单胞菌。
“微氧条件”是指在发酵过程中不添加气体(氧气、空气、氮气等等)于发酵罐中，而发酵培养液表面暴露在空气中。运动发酵单胞菌在生长和产乙醇阶段，不需要空气或氧气(好气)或氮气(厌气)，但能耐受发酵培养液表面的空气。
优选的微生物菌株-运动发酵单胞菌中产率高的菌株已保藏在澳大利亚的Queensland大学微生物学系，保藏号UQM2716，和美国菌种保藏库(ATCC)12301，美国马里兰州20852，1984年4月24日的保藏号为39676。
这菌株是通过连续培养技术从国家工业细菌保藏委员会的NCIB11199，英国Torry研究所的AB9 8DG，和ATCC的29191中筛选所衍生出来的。筛选决定于特性改进与蔗糖转化的代谢率的改进，这些特征只是在ATCC 29191亲本菌株分类学的描述上有差异，其描述请见《伯氏细菌鉴定手册》第8版(1975)第576-580页。其亲本菌株NCIB11199/ATCC.29191和Zymomonas mobilis其它的菌株也能应用。
最好得自甘蔗或甜菜的蔗糖，以及以精制糖、精制糖、甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜(含有蔗糖渣、蔗糖水解物和/或转化糖)或其类似物，或其它任何一个基质的复合物形式，都可供发酵罐用。
为了获得最高产率的乙醇，适用的蔗糖浓度在10-30%范围，糖浓度15～25%间更好，最好用的蔗糖浓度是20%。
在用精制糖或粗制糖时，培养液中最好要包含任何一种或多种下列成份，酵母浸出液;蛋白胨(酪蛋白水解物);磷酸二氢钾;硫酸铵(NH4)2SC4或尿素;和硫酸镁(MgSO4·7H2O)。这些成份每一个提供的适宜的浓度范围为0.01～0.5%，最好用0.2%。
上面指名的培养基成分也可用加入适当浓度的甘蔗汁，甜菜汁或糖蜜代替，因为在这些汁中或糖蜜中发现含有上述培养基成分。
对于甘蔗汁或其浓缩液，甜菜汁或其浓缩液和糖蜜的任何一种作为发酵基质时，不需要额外补给任何其它物质。
最好在发酵过程中pH保持在4.0-7.0间，开始时pH最好为6.5～7.0间，随着发酵过程的进行pH值下降，以后如1-2小时后，pH保持在0.5～6.0间。pH范围可用加氢氧化钠或其它合适的碱性物质进行控制。
发酵罐的温度最好维持在34-40℃间，并最好控制在35℃的恒定温度。
在发酵过程已完成时，微生物最好用过滤，离心等方法从发酵液中分离出来，而乙醇则被蒸馏出来。
为使本发明使人完全明白，现将方法的最佳实施例叙述如下。在所有实施例中，百分率都表示为“%重量/体积”1%相当于10克/升。
实例1(开始生长和产乙醇阶段-实验室规模)。
用甘蔗汁为基质1800毫升含有12.1%蔗糖的甘蔗汁放入2升的发酵罐中。
把在微氧条件37℃生长于下列培养基的200毫升运动发酵单胞菌(ATCC 39676)，经12-24小时培养后的种子培养物，放入发酵罐中。培养基含有10%蔗糖，0.2%酵母浸出液，0.2%酪蛋白水解物(蛋白胨)，0.2%磷酸二氢钾，0.2%MgSO4·7H2O，0.2%硫酸铵。发酵过程的pH值开始前调到6.8。过第一个1-2小时后，pH下降到6.0，然后用添加2N氢氧化钠(80克/升)控制在6.0。在35℃，100转/分搅动速率下完成培养。
经24小时发酵后，被利用的糖全部转化为乙醇，其浓度为60.8克/升或6.08%(重量/体积)。
实例2(生长和产乙醇阶段-实验室规模)
以甘蔗汁为基质90升含有15.2%蔗糖的甘蔗汁放入100升发酵罐中。
把10升生长在与实例1相同的培养基上的运动发酵单胞菌(ATCC 39676)经12-24小时培养的种子培养物放入发酵罐中。开始pH调到6.8，在发酵过程中，pH用加入8N氢氧化钠控制pH6.0或5.0。在35℃250转/分搅动速率下完成培养。
经26小时发酵，所利用的糖全部转化为乙醇，其浓度达85克/升，或8.5%(重量/体积)。
实例3(生长和产乙醇阶段-实验室规模)
取精制糖为基质1800毫升含有9.69%(96.94克/升)精制蔗糖，0.2%酵母浸出液，0.2%酪蛋白水解物(蛋白胨)，0.2%硫酸铵，0.2%MgSO4·7H2O和0.2%磷酸二氢钾的发酵培养液放入2升发酵罐中。
把200毫升生长在例1所用培养基上的运动发酵单胞菌(ATCC39676)经12-24小时培养的种子培养物放入发酵罐中。开始pH调为6.8。在发酵中用2N氢氧化钠控制pH在5.0或6.0。在35℃，100转/分搅动速率下完成培养。
经10小时发酵后，发酵完成并完全转化为乙醇，其浓度达4.7%(重量/体积)或47.22克/升。
实例4(生长和产乙醇阶段-实验室规模)
用精制糖为基质1800毫升含有18.25%(182.54克/升)精制蔗糖。并把和实例3叙述的营养成份的发酵培养液加到2升发酵罐中。
把200毫升生长在与实施例1相同的培养液的运动发酵单胞菌(ATCC 39676)经12-25小时培养后的种子培养物放入发酵罐中。开始pH调为6.8。在发酵中用添加2N氢氧化钠以控制pH在5.0或6.0。在35℃以100转/分搅动速率发酵完成培养。
经19小时发酵后，得乙醇，其浓度为8.94%(重量/体积)或89.44克/升。
实例5(生产乙醇阶段-实验室规模)
用精制糖为基质这个实例是连续应用罐中的细菌发酵液作为种子培养物以用于后续的批量发酵。把200毫升由实例4得来的发酵物作为种子培养物加入到具有相同成份的1800毫升发酵培养液中，在相同的培养条件下，经19小时完成发酵，使产生相同浓度的乙醇。
这种重新使用发酵液，不需要过滤，浓缩或离心，能成功地反复应用到6次。
实例6(产乙醇阶段-实验室规模)
用工厂的粗制糖(蔗糖)为基质利用工厂的粗制糖和实例4的发酵液进行发酵，并只需要加入0.05%泛酸钙，0.02%(MgSO4·7H2O)和0.02%磷酸二氢钾(当甘蔗汁或其浓缩液作为基质时，不需要再补给物质)。
实例7(生产乙醇阶段-实验室规模)
用精制糖为基质把1800毫升含有15%(150.0克/升)精制蔗糖，0.2%酵母浸出液，0.2%酪蛋白水解物(蛋白胨)，0.2%硫酸铵，0.2%MgSO4·7H2O和0.2%磷酸二氢钾的发酵培养液放入3升的发酵罐中。
把200毫升与加在发酵罐中培养液相同的培养基上生长的运动发酵单胞菌(NCIB11199/ATCC29191)经12-24小时培养后种子培养物加到发酵罐中。开始pH调为6.8，发酵后下降到5.0或6.0。在发酵中用添加2N氢氧化钠控制pH在5.0或6.0。在35℃，100转/分搅拌速率下完成发酵。
经45小时后，发酵完成得乙醇，其浓度为6.1%(重量/体积)或61.21克/升。
实例8(生长和生产乙醇阶段-工业化规模)
把100升实例4发酵后的发酵液作为种子培养物，放入3000升的发酵罐中。开始pH调为6.8，发酵后pH下降到5.0，在发酵中用添加2N氢氧化钠维持pH在5.0。
经12-24小时发酵后，再加入27000升发酵营培养于罐中，使罐充满，再重复加上的发酵条件。
经24-30小时发酵后，27000升发酵后的发酵液从罐中用泵压出，罐中发酵液的乙醇浓度为9.5%(重量/体积)。
把27000升发酵营养液再加入罐内留有的3000升剩余发酵液中，重复进行发酵。
利用上批发酵后的剩余发酵液作为运动发酵单胞菌的种子培养物，这一发酵过程能重复进行数次，其产物的乙醇浓度能保持在9.5～10%(重量/体积)的范围内。可注意的是，运动发酵单胞菌细胞在发酵培养液中生长迅速，在加入新鲜发酵培养液菌体开始生长后，其菌体生长和产乙醇二者能同时进行。
实例9(生长和生产乙醇阶段-实验室规模)
9升含有1600克蔗糖，500克糖蜜，5克硫酸铵，5克MgSO4·7H2O(总共1800克蔗糖)的发酵培养液加入14升发酵罐中。
把1升生长在前述培养基上的运动发酵单胞菌(ATCC 39676)培养物作为种子培养物加入14.0升的罐中。pH值调到7.0，控制pH并使维持在6.0。培养温度为35℃，搅拌速度每分为100转。
经36小时后，蔗糖被利用并产生89.6克/升(8.96%重量/体积)(或11.3%体积/体积)的乙醇。
将4升发酵液经4000转/分离心10分钟后，作为用于下批发酵的种子培养物。
将9升含有1500克蔗糖，500克糖蜜，5克硫酸铵，5克MgSO4·7H2O(总共1600克蔗糖)的发酵培养液加入到14升发酵罐中。
加入1升上批由4升发酵液经处理后的培养物重悬浮液。pH调为7.0，发酵后控制pH使维持在5.0。培养温度为35℃，搅拌速度为100转/分(8pm)。
经17小时发酵完成后，产生76.69克/升(7.67%重量/体积)(或9.7%体积/体积)的乙醇液。
表1列出的是用2升台式发酵罐(bench-top)和100升中间试验发酵罐和各种浓度的精制糖(蔗糖)进行发酵试验的结果。
利用运动发酵单胞菌的其它菌株，包括亲本菌株NCIB 11199/ATCC 29191也能进行发酵，但用ATCC 39676菌株能产生最好的结果。
所生产的乙醇具有商业价值，能作为汽油醇(gasohol)的成份或化学工业的基础产品，如用于生产乙烯，而其他付产品，二氧化碳，能制作干冰或作为藻类生物量生长的碳源。
由于微生物在发酵过程中，产生大量的热量，所以整个发酵过程仅需输入很少的能量。此外，发酵过程是在微氧条件下进行，不需要通气或附加氮气泵，发酵液成份和产物基本不需机械搅拌和pH的控制。
试验表明，发酵的成功不是全部取决于作为基质蔗糖的质量。即使用腐烂的甘蔗进行发酵试验也能成功，这说明本发酵方法特别适合于工业应用，和发酵罐能邻近糖厂以减少运输费用。由于甘蔗汁不需要灭菌，所以输入能量能保持在低水平。
本发明不限于上述的特殊实施例，只要不超出下列附属权利要求
书的范围，对实施例作各种变动和修改都是可以的。
权利要求
1、在发酵罐中，从蔗糖(或其水解物或转化糖)发酵产生乙醇的方法，其特征在于用微生物运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)在微氧条件下，使蔗糖一步发酵产生酒精，其中蔗糖包含在发酵培养液中。
2、按照权利要求
1的方法，其特征在于运动发酵单胞菌是保藏于美国标准菌种库(ATCC)的菌株，其保藏号为39676，或为ATCC 39676的突变体或变异株。
3、按照权利要求
1的方法，其特征在于运动发酵单胞菌是保藏于ATCC的菌株，其保藏号为29191。
4、按照权利要求
1到3中任何一条的方法，其特征在于加入发酵培养基中的蔗糖是精制糖，精制糖，压榨后的甘蔗汁，甜菜汁，糖蜜或以上两种或多种蔗糖料的混和物(包括蔗糖水解物或转化糖)的形式。
5、按照权利要求
1到4中任何一条的方法，其特征在于蔗糖浓度在10～30%(重量/体积)的范围。
6、按照权利要求
5的方法，其特征在于蔗糖浓度在15～25%(重量/体积)的范围。
7、按照权利要求
6的方法，其特征在于蔗糖浓度是20%(重量/体积)。
8、按照权利要求
1到7中任何一条的方法，其特征在于发酵培养液中含有如下的一种或多种成份蛋白胨，酵母浸出液，磷酸二氢钾，硫酸铵，尿素或硫酸镁。每一成份的浓度在0.01到0.5%(重量/体积)的范围内。
9、按照权利要求
8的方法，其特征在于每一成份的浓度是0.2%(重量/体积)。
10、按照权利要求
1到9中任何1条的方法，其特征在于发酵培养液的pH值保持在4.0-7.0的范围。
11、按照权利要求
10的方法，其特征在于发酵开始时pH在6.5-7.0间，发酵进行后PH下降然后维持在5.0～6.0间。
12、按照权利要求
1到11中任何一条的方法，其特征在于发酵罐的温度维持在34℃-40℃的范围。
13、按照权利要求
12的方法，其特征在于温度保持为35℃。
14、按照权利要求
1到13中任何一条的方法，其特征在于当发酵完成时，微生物运动发酵、单胞菌从发酵液中分离出来，而乙醇被蒸馏掉。
15、按照权利要求
1的方法，其特征在于运动发酵单胞菌包括悬浮在发酵培养液中运动发酵单胞菌的细胞。
16、按照权利要求
15的方法，其特征在于上批发酵后的部分发酵培养液被加到发酵罐中作为接种运动发酵单胞菌细胞。以进行后续发酵。
17、运动发酵单胞菌的一个菌株保藏在美国标准菌种库(ATCC)，其保藏号为39676。
18、ATCC 39676运动发酵单胞菌的一个突变体或变异株。
19、按照权利要求
1到16中任何一条的方法，从蔗糖(或其水解物或转化糖)发酵产生的乙醇。
专利摘要
本文发展一种新的，从精制蔗糖、粗制蔗糖、甘蔗汁、甘蔗糖蜜、蔗糖水解物和转化糖，应用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)一步发酵生产商业性的乙醇产品。本发酵法的蔗糖水解率为94～98％，乙醇的转化率为95～98％。在24-30小时内，200克/升蔗糖能转化产生95.5克/升乙醇。发酵后的发酵液反复接种，无需离心或用膜过滤。
文档编号C12P7/06GK86101245SQ86101245
公开日1986年10月8日 申请日期1986年2月20日
发明者霍斯特·沃纳·多尔 申请人:昆士兰大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan