专利名称:通用的核酸内切限制酶的制作方法
本发明涉及新的通用的核酸内切限制酶类以及生产这种内切酶类的方法。更具体地说，藉着一种寡脱氧核苷酸接合体与一种已知的核酸内切限制酶结合，本发明涉及到的核酸内切限制酶使人们在实际上可裂解任何预定的DNA序列。
核酸内切限制酶是一类在细菌体内自然产生的酶类。当将它们从其它的干扰的细胞组分中提纯出来后，就可在实验室中用来将DNA分子切割成精确的片段，此种性质能使DNA分子成为异常等同的及精确地分离成其组分亚单位。已经证明，核酸内切限制酶类是当今遗传研究中不可缺少的工具。它们是生物化学的“剪刀”，可应用来进行遗传工程及分析。
核酸内切限制酶可分为三类。在相同的蛋白质部份中，类-Ⅰ及类-Ⅲ酶承担饰变(甲基化作用)及一种ATP-需要的限制性(裂解)活性。两种类型的酶都可识别在基质DNA中未甲基化的识别序列，但是类-Ⅰ酶类的裂解基本上是不规则的，而类-Ⅲ酶类则在特定的位点上切割DNA，通常是在距它们的识别位点上的一个恒定的距离来切割。
类-Ⅲ限制/修饰系统包括一种分隔的核酸内切限制酶及修饰甲基酶。这些酶在DNA上接近特殊的识别序列处或在序列内切割DNA，典型的识别序列其长度为4至6个核苷酸单位，通常是两个弯折对称轴的距离。存在着多于500个的可在DNA上特定的位点裂解DNA的类-Ⅱ核酸内切限制酶。不同的识别位点的数目大于100(不算各种修饰作用，包括甲基化作用)(参阅Roberts，核酸研究，13∶r165，1985;Kessler等人，基因，33∶1-102，1985)。虽然存在的裂解位点的所有数目其数值很大，但仍常常需要增加切割位点，使之有可能进行精确的基因工程及调整序列。目前，还不能有效地评估一个序列中何处是最有利的限制性位点，人们通常应用多种的方法来建造序列，包括插入适当的连接子，突变的产，或核酸外切分离的消化作用(exonuleolytic digestion)。但是，这些创造新位点的方法改变了所研究的核苷酸序列并经常会影响其功能。
按照本发明，提供了对于限制性酶类工程的一种新的途径，而这种酶能够在特别预定的位点上裂解DNA。在一种具体的实施中应用了类-ⅡS或“转换”酶。类-ⅡS酶类的定义为可在双股(简称ds)DNA上距识别序列的精确距离处裂解该DNA的类-Ⅱ核酸内切酶类。某些类-Ⅲ酶类也可在实施本发明中应用，特别是能够在距DNA链识别位点的一个适当的恒定距离处(在约20-25核苷酸)裂解DNA的那种类-Ⅲ酶类。用于切断两个识别位点(例如，BstⅪ酶;见基因40∶173(1985))之间的位点的类-Ⅱ酶类也可应用于本发明的技术中。
本发明藉酶与一种适当地设计好的寡脱氧核苷酸接合体，利用识别位点与切割位点之间的分隔，使类-Ⅱ或类-Ⅲ酶类实际上能切割几乎任何预定的序列。接受体是由恒定的识别位点区域(一种含发夹结构的双股序列)及一种可变的，与被裂解的靶单股序列互补的单股(以SS表示)区域构成。被裂解的单股序列可由单股噬菌体DNA，有缺口的ds质粒，碱变性和迅速中和的超螺旋化ds质粒或其类似物等所提供。这三种组分的混合，即类-ⅡS酶，SS DNA靶序列，及互补的接合体，形成一种新的核酸内切限制酶复合体，此复合体可使靶DNA在特定的位点上裂解。本发明的另一个优点是应用适当DNA聚合酶、利用接合体寡脱氧核苷酸作为一种引物，可将靶SS DNA转变成精确裂解的ds DNA。
因此，根据本发明，提供了一种利用合成的设计而产生的一种具有预定限制的特异性，而实际上几乎是无限多的各种各样的新核酸内切酶，从而改变核酸内切限制酶特异性的方法。
图1 说明一种用于指示FokⅠ类-ⅡS酶在一个预定的点上裂解M13 SS DNA的寡脱氧核苷酸接合体的设计方案。
图2 说明供FokⅠ核酸内切限制酶使用的两个寡脱氧核苷酸接合体。
图3 表示M13mp7 SS DNA的示意图。
图4 表示由FokⅠ、HphⅠ、HpaⅠ、MboⅡ、MnlⅠ、SfaNⅠ及BbvⅠ的凝胶消化ds及SS M13mp7 DNA的翻印照片。
图5 说明一种寡脱氧核苷酸接合体及它对FokⅠ裂解的非敏感性结构。
图6 说明在图2中说明的32-单体及34-单体接合体的存在下，M13mp7的FokⅠ消化作用的凝胶图片。
图7 表明用于消化M13mp7的一种预制成的FokⅠ酶一接合体复合物的凝胶图片，也表示了在接合体与靶DNA之间的盐浓度效应及退火条件。
图8 表示M13mp7 ds DNA的示意图。
本发明提供了有目的地设计的寡脱氧核苷酸接合体，它可用于改变核酸内切限制酶的特异性。此类接合体可指示这类酶在一个预设计的靶位点上裂解DNA。换句话说，可以被连接到新的合成的“辅酶”上的寡脱氧核苷酸接合体，给予核酸内切限制酶一种新的底物质特异性。
本发明的寡脱氧核苷酸接合体被用来仿制存在于某些核酸内切限制酶的识别位点与切割位点之间的关系，以便于提供具有实际上在靶DNA的几乎任何预定的位点上切割DNA能力的经修饰过的核酸内切酶。按照本发明，优选的修饰过的限制性酶，是类-ⅡS酶，因为此种酶可将裂解的位点转移到一个距识别位点相当远(达到13个核苷酸)但是精确的位点处。在表Ⅰ中列出了11个类-ⅡS限制性酶的识别位点及裂解位点的位移。根据本发明，此种类-ⅡS酶可以设计成应用合成的寡脱氧核苷酸接合体分子去指示该酶，以识别及切割任何预定的DNA序列。正如上文所指出，较好的类-Ⅲ酶类是可在距它们的识别位点大约20-25个核苷酸单位处切割的那些酶，而其他的类-Ⅱ酶类如BstⅪ也可按照本发明所述的内容，应用相似的接合体将其改变成具有与通用的核酸内切限制酶相似的功能。这些酶包括EcoP1、EcoP15、HineⅠ及HinfⅢ;见Kessler等人，supra，67-68页。
a.由于识别位点不是回文结构故列出两种取向。箭头所指明的仅仅是第一种酶所裂解的位点。
b.指出了限制性位点的5′或3;突出的SS末端和给出了它们的长度。
c.参阅Kessler等人的评论，(supra)，及所指明的页数及项目数。
d.市场上可买到的(如New England Biolabs;见Kessler等人，supra)。
e.对于M13 SS DNA没有核酸内切分离的活性(endonucleolytic activity)。
f.被试验的一批酶显示出对M13 SS DNA的核酸内切分离活性(endonuc-leolytic activity)。但是可以将该酶提纯以除去核酸内切分离的活性(endonucleolytic activity)。
g.Py＝T(胸核苷)或C(胞核苷);Pu＝A(腺核苷)或G(鸟核苷)。作为切割点，见Roberts，supra。
现参见图1，图中显示当应用于FokⅠ核酸内切酶时本发明的原理的大纲。图1a表明FokⅠ识别位点，GGATC、CCTAC与在正常ds DNA分子上的交错位点之间的关系。仿制上述排列的接合体寡脱氧核苷酸(图1b)包含发夹ds区域，它携带FokⅠ识别序列(下有黑线)，及一个SS区域，此处在与互补的靶DNA链配对后会发生裂解。因此，接合体的ds区是一个具有类-Ⅱ酶类特异性的恒定部份，而SS区域是可变的，它根据本发明可被设计成可以在互补的靶DNA链上的任何选择的位点上裂解。
接合体的设计在图1b中描绘的寡脱氧核苷酸是为了用于类-Ⅱ FokⅠ酶及由M13噬菌体而来的SS靶DNA而设计的接合体的一个例子。34-单体的发夹ds区域包含用于FokⅠ的5′-GGATC识别位点;它的SS区3′-CCTAC是被设计来引导在靶M13 DNA上的T(胸核苷)与C(胸核苷)之间裂解的。在接合体与M13 DNA之间的复合物(图1c)仿制了含有FokⅠ识别位点及ds裂解位点(见表1及图1c)的一种ds组件(图1a)。依靠接合体的SS区域的序列，该酶会在靶DNA上的任何选择的位点上切割。在此同时，接合体的3′-末端(见图1b，c)可以在与靶SS DNA互补链的合成中用作引物，在用所有的四个dNTPs的一个步骤中，或在两个步骤中即用三个dNTP′s的一种有限度的合成(在FokⅠ消化作用之前，粘住接合体的3′末端，但不是很彻底的，以提供用于FokⅠ的ds识别位点)，接着，在FokⅠ裂解之后，合成整个的互补单链。
图1没有指出最佳的接合体设计。最佳化包括(ⅰ)确定对于GGATG识别位点的左边及右边最有效的发夹距离;(ⅱ)改变对于裂解的SS DNA互补的SS区域的距离和/或为引物功能创造条件;(ⅲ)根据GGATG及裂解位点，修改SS M13 DNA分支(图1b)的位置;(ⅳ)比较接合体与5′及3′SS区域(见图2));(ⅴ)在接合体的SS区可能应用的双关的核苷酸(次黄苷酸)或核糖核苷酸;以及(ⅵ)用紫外光照射在发夹尖端的活性脱氧核苷酸(如5-碘脱氧尿苷酸)内含物，以便形成共价的(但有活性)接合体-酶复合物。也可应用使接合体-酶复合的其他方法。接合体的最佳化设计也促进了对核酸内切限制酶的核酸内切分离活性(endonucleolytic activity)机制有较多的了解。
虽然必须为每一种选出的裂解位点设计出一种特别的接合体，但是只有对可变的SS区(5至15核苷酸)才必须定做。它可以是(ⅰ)用作一种拼接的支持物，设计成与SS区及发夹的邻近序列互补的一套寡脱氧核苷酸，连接到恒定的ds发夹区的干上，或者(ⅱ)在其制备的第一阶段的合成中，把保留的保护基团供给恒定的发夹区域，而在第二合成阶段加入可变的SS区。这种用于含有5′SS区域(见图2a)的接合物的两步有机合成是可能的，因为核苷酸的偶合方向是由3′至5′的。
虽然用于许多序列的接合体的合成必须定做，根据本发明，可以制备用于大量的经常可碰到的序列(现时没有对它们适用的酶)的接合体的设备。
靶DNA及载体(1)单股DNA应用SS靶-载体DNA(如在图1中所表示的以M13 SS DNA作为例子)的一个主要的优点是，它不能为大多数的类-ⅡS酶(它经常是ds载体的切割机)提供识别位点。一些市场上可买到的类-ⅡS酶类(FokⅠ，HphⅠ，MboⅠ，BbvⅠ;New England Biolabs);对于M13 DNA没有干扰核苷内切的活性。可从多种来源得到SS靶DNA，包括SS DNA噬菌体载体(M13，fd，f1)或任何带有这些噬菌体的复制原(Ori)的ds质粒，而这些噬菌体通过噬菌体超级感染将ds质粒转变成包裹的SS DNA。
(2)具SS缺口的双股DNA另一个基质可以是具有适当地设计成的SS缺口的ds DNA，但是在这种情况下，较好的应该是ds裂解位点要末不存在要末受到(ⅰ)甲基化或dsDNA的其他改变，或者(ⅱ)以接合体及可能的共价结合使酶饱和而使之不活泼。为了FokⅠ位点的特异的甲基化作用，可利用一种FokⅠ甲基化酶(New England Biolabs)。关于形成4-核苷酸粘性末端的类-ⅡS酶类，裂解的质粒的再连接，须要恢复其原来的排列，因为每一个裂解的序列是独特的。但是，如果未切割的接合体被移去，在SS缺口中的切割将保持敞开。如果接合体一中间的FokⅠ裂解的目的是产生具有一种特殊终端的小片段，在ds DNA上额外的FokⅠ切割将会是无关重要或是同样有利的。
(3)双股DNA除了在上面说明的问题之外，应用ds DNA基质需要一种将接合体的SS区插入ds靶序列的特别方法。当应用超螺旋的质粒DNA的碱变性作用接着用快速的中和作用得来的可逆变性的靶DNA时，这种方法应是可能的。这种方法的结果，使大部份所显示的变性分子与引物寡核苷酸退火(Chen与Seeburg，DNA 4∶265-170，1985)。应用一个单独的接合体会造成一个SS裂口，然而两个接合体，仅仅有重叠或相邻的SS区与相对面的链互补会造成交错的切割。另一方面此种作用可以应用催化剂如RecA-相似的蛋白质，缓和的变性条件，或应用在接合体的SS区中的核糖核苷酸。同样有利的是应用在图1或图2b中所示的接合体，如上所述应用该接合体的3′-OH末端作为引物以合成互补链，可得到ds DNA。
通过小心地设法使合成的接合体分子与类-ⅡS或类-Ⅲ核酸内切限制酶相结合，本发明可以得到新的裂解特异性的结构。根据本发明创造出无限数量的新的酶的特异性“新的限制性酶类”其主要限制在于寡脱氧核苷酸合成器的效能。
虽然本发明的基本目标是类-ⅡS核酸内切限制酶，但根据本发明的学说，也有可能设计用于酶的接合体，以识别一种由非特异的碱基对作用而分离的逆转了的复制物。例如
该接合体能转变BstⅪ酶(见Kessler等人，supra)成为找寻一种与接合体的中央NNNNNN SS区互补的SS序列的核酸内切酶。也可设计出其他许多种类的接合体。
下述例子对本发明的实施给予进一步的说明，而在本发明目前的实际应用中是较好的。应该认为这些例子是说明性的，而除了在所附的权利要求
书中所指出的之外，不应被认为限制了本发明。
实施例Ⅰ本例叙述了为选择靶DNA、靶序列、限制性酶而设计的方法，以及监察裂解过程的方法。
(a)靶DNA的选择为了达到本实施例的目的，选择了一种噬菌体M13衍生物作为SS DNA的来源，因为(ⅰ)已经知道它的全部核苷酸排列顺序(Van Vezenbeek等人，基因11∶129-148 1980;Yanish-Perron等人，基因33∶103-119 1985)，(ⅱ)M13mp噬菌体是方便的无性繁殖载体，以及(ⅲ)ds复制的形式(RF)及SS DNA两者都易于繁殖。在M13衍生物中，选择M13mp7载体噬菌体，因为它的SS DNA含有一个小的发夹结构，该结构被设计成可用酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、AccⅠ及SalⅠ〔Messing，酶学的方法(Method in Enzymol)101∶20-78，1983〕来分解的。如在图3中所描绘的，应用FokⅠ-接合体复合物，这些切口提供了参考点以便为SS切口绘制确定的图。
在图3中的粗线代表SS DNA。发夹“a”的序列如下
在位置Ⅰ上的两个切口(图3)与在图2中所叙述的相同。已经发现，在位置Ⅱ上切口的地点是被安置在近核苷酸6938处。整个M13mp17的长度是7238个核苷酸，而各片段的大约长度a是32;b是670;C是1640;d是4890;b+c是2300;a+b+d是5600个核苷酸。该图没有按比例绘制。
(b)靶序列的选择应用威斯康辛大学遗传计算机组合在DESCSVAX 7800的计算机程序(Devereux等人，核酸研究12∶387-375 1984)，已经发现在M13mp7 SS DNA的14-核苷酸序列，它满足了下列标准(ⅰ)它是独特的，(ⅱ)在噬菌内DNA中没有出现具有一个、两个或三个失配的相似序列，(ⅲ)在噬菌体中没有出现具有0-2失配的互补序列，以及(ⅳ)在选择的序列中的切口和在参考的EcoRⅠ位点上的切口(见在图3中的切口Ⅰ及EcoRⅠ)会产生两个易于在硅胶上分辨及量度的片段(略去由EcoRⅠ切下的32-核苷酸发夹片段)。选择出一个14-核苷酸单独的序列5′-TGCTACCCTCGTTC-3′(核苷酸1339-1352)，与在M13mp7 SS DNA上没有发现有0-3核苷酸错配，以及仅有3个分散的4-核苷酸错配(在1749，2908及5599处开始)，和没有0-2核苷酸-错配-互补序列(它可能已为配对的接合体所干扰)。唯一的3-核苷酸错配互补序列在核苷酸5443处开始。
(c)限制性酶的选择测试市场上可买到的所有类-ⅡS酶类显示，其中有四种酶(FokⅠ，HphⅠ，MboⅡ及BbvⅠ)对SS M13mp7(图4)不显示核酸内切分离的活性(endonucleolytic activity)。图4说明复制形式RF ds(第1，3，5，7，9，11，13道)和SS(第2，4，6，8，10，12，14道)M13mp7 DNA被FokⅠ(8u;第1，2道)，HphⅠ(8u;第3，4道)，HpaⅠ(2u;第5，6道)，MboⅡ(20u;第7，8道)，MnlⅠ(2u;第9，10道)，SfaNⅠ(2u;第11，12道)及BbvⅠ(2u;第13，14道)裂解。所有的酶均由New England Biolabs赠送。在ds DNA制造者建议的条件下，应用所指示的酶单位数(u;见上文的括弧中)每20微升消化混合物每2微克DNA，在37℃下进行消化作用3小时。样品制备及SS M13mp7 DNA的电泳条件与下文关于图6的叙述相同。样品的制备及dsDNAs的消化作用的条件与Maniatis等人(1982)所叙述的相同。用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色并应用紫外光穿透-照明摄影DNA。由于在第一阶段FokⅠ受过挑选，因为先前对于此种酶的经验，及因为一种FokⅠ甲基化酶已经面市，使得有可能在预先存在的限制性位点保护ds DNA免受FokⅠ消化。
如在图4中所见，类-ⅡS酶类HgaⅠ及MnlI显示在M13mp7 SS DNA上的多种切割，而SfaNⅠ似乎含有某些对于SS DNA为非特异性的核酸内切分离的活性(endonucleolytic activity)。所有7种酶都显示预期的ds切割，而除了MboⅡ之外，在这方面Dam甲基化作用妨碍了少数的切割(见Kessler等人，supra)。
(d)接合体的设计由于FokⅠ识别序列GGATGCCTAC是不对称的，如在图2中所表示及解释的，建造了两种不同的寡脱氧核苷酸接合体，“左边”(32核苷酸)及“右边”(34核苷酸)。预期它们在M13mp7靶SS DNA上支配两种不同的切割，相距8个核苷酸(图2和3)。该结合体由两个区域组成(见图1)(ⅰ)含有FokⅠ-识别ds位点的恒定的ds(发夹)区域，及(ⅱ)在上文b段中叙述的，与靶序列互补的不同的SS区。左边的接合体，与在其3′末端的发夹结构，使得有可能进行两步合成(ⅰ)第一步，以被护形式大量供给恒定的ds区域，由3′-端至5′-端的有机合成，及(ⅱ)接着加入一些预先设计好的与所选择的靶序列互补的SS区域。适当的接合体与在其5′末端的发夹ds区域，使得有可能用其3′末端作为合成M13mp7 DNA的整个互补链的引物。
(e)接合体的确定如在图5中所见，接合体能以一种发夹单体存在(见图2)或者形成一个二聚体，如下列，它与适当的接合体相对应5′-CACATCCGTGCACGGATGTGGAACGAGGGTAGCA-3′3′ACGATGGGAGCAAGGTGTAGGCACGTGCCTACAC-5′以中央的20-碱基对其回文结构对几种限制性酶(包括HgiAⅠ及Bsp1286)敏感。当在不发生变性的条件下进行电泳(图5，A-道1及B-道1)可观察到二聚体。当使用碱性样品混合物或在填充的缓冲液中以70℃处理时，二聚体的带即消失(图5B，分别于第2道及第3道)。在FokⅠ缓冲液中，在70℃变性的34-单体部份是可逆的(图5A第3道)。单体与二聚体两者都应具有接合体活性。
(f)接合体对FokⅠ酶的敏感性由于期望FokⅠ酶只切割由于M13靶序列与接合体之间通过退火而形成的复式结构，有必要显示在互补的DNA链不存在时;该酶不会裂解接合体的SS区域。图5说明接合体的结构及它对FokⅠ裂解的不敏感性。
在图5a中，所有的道都含有悬浮于FokⅠ缓冲液中的1克34-核苷酸接合体(见图6)并在70℃加热5分钟(第3-4道)或不用热处理(第1-2道)。在第2与4道中的接合体以FokⅠ处理(如与图6有关的叙述)。在20%聚酰胺凝胶上，在三-硼酸盐(Peacock)缓冲液(Maniatis等人，1982)存在下进行电泳5小时(电压为200伏)。每一个槽都装入20微升接合体溶液及5微升含有溴酚蓝的填充缓冲液(Maniatis等人，1982)。
在图5b中，所有的电泳道都含有悬浮于20微升填充缓冲液(10%甘油，7%蔗糖，2.4%聚蔗糖(Ficol);不含溴酚蓝)-第1和2道;或悬浮于20微升碱性填充缓冲液中-第3道中的2微克的32-核苷酸接合体。将在第2道中的样品在70℃加热5分钟。样品(20微升)的电泳与在底板A上相同。用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓对所得的带染色并如图4摄象。(a)二聚体，(b)单体，(c)溴酚蓝指示剂。由于单独的结合体不会被FokⅠ裂解，故提供了在图5A中显示的情况(第2及4道)。正如上文(d)段中所述，可观察到接合体分子的二聚化作用。
(g)在SS M13mp7 DNA中裂解的监测应用琼脂糖凝胶(1.4%)电泳监测SS环状DNA的裂解(如Been与Champoux，酶学的方法，101∶90-98，1983所叙述)。单独的切割将DNA环转变为线性DNA，它的移行比封闭的环快些(图6;由CF转变为LF)。由于在M13mp7 DNA上的重复逆转而形成的发夹上有一个EcoRⅠ位点，将用EcoRⅠ进行的消化作用作为对照(图3)。
实施例Ⅱ本例叙述应用酶-接合体复合物在一个预定的位点上裂解SS DNA(a)应用FokⅠ限制性酶在左边(32-单体)及右边(34-单体)接合体的存在下，M13mp7 SS环状DNA的消化作用图6说明在平面的1.4%琼脂糖凝胶的三-硼酸盐(Peacoak)缓冲液中，以120伏电压对线性及环状形式的M13mp7 SS DNA进行电泳分离3小时，而且通常接着进行Been及Champoux，supra的工艺程序。M13mp7 SS环状DNA可用Maniatis等人(1982)所叙述的方法制备。每一条道含有2微克的这种DNA(ⅰ)悬浮在总体积为20微升的FokⅠ缓冲液中(20毫克分子KCl，10毫克分子三·盐酸缓冲液，pH7.5，10毫克分子氯化镁，0.5毫克分子二硫苏糖醇(DTT)，(ⅱ)消化的或其他的处理，(ⅲ)在-70℃，在0.3M的乙酸钠存在下，用4体积的95%乙醇沉淀10分钟，在微型离心机中离心10分钟，(Ⅳ)用70%乙醇洗涤并在真空中干燥，再悬浮于20微升碱性样品混合物(30毫克分子NaOH，2毫克分子EDTA，7%聚蔗糖(Ficoll)，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)及0.01%的溴酚盐)中。用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓使DNA带染色(见图4)。
第1道(图6)含有未处理过的M13mp7 DNA〔上部的带，环状的形式(CF)高于90%而下部的带，线性的形式(LF)少于10%〕。第2道含有在37℃，在FokⅠ缓冲液中以12单位FokⅠ/20微升处理2小时的相同的DNA(见上文)。第3与4道含有分别由15-倍克分子过量的32-单体与34-单体接合体杂交的相同的DNA。杂交的过程包括在70℃加热5分钟，接着在FokⅠ缓冲液中在37℃保持1小时。在代表反面对照(negative controls)的第1至4道中DNA没有裂解，第5与6道代表与在第3及4道中相同的处理，接着，如在第2道中那样用FokⅠ消化。此处可看到M13 SS DNA的特异性裂解。第7道代表，作为正面的对照，即在FokⅠ缓冲液中加上三·盐酸缓冲液至100毫克分子(pH7.5)用EcoRⅠ(16单位/20微升，1小时，27℃)消化。第8及9道代表与在第5及6道中相同的处理，接着如在第10道(它提供FokⅠ接合体切割位点的场所)中那样，用EcoRⅠ消化1小时。在图6的第5及第6道中，符号a+b+c及c指的是(电泳)带而在图3中指相应的片段。作为大小的标志见图7。
(a)如图6中所示(第1-4道)既不是FokⅠ单独地也不是接合体单独地裂解环状M13mp7 DNA。
但是，当左边或右边接合体首先与SS DNA退火接着加入FokⅠ，则该环以超过90%的效能被线性化。两种接合体都参与核酸内切分离的反应(endonucleolytic reaction)，但是看来右边的(34-核苷酸)接合体有较高的效能。
(b)用FokⅠ-结合体组合物第二次切割细心地检查在图6中的第5与第6道以及图7中的第2-6道，可发现除了代表整个线性的M13mp7的SS DNA的7238-核苷酸带之外，还有另外两条带。这两条次级带的出现看来有赖于反应的条件。
(C)在M13mp7 DNA中切割的绘图对于确定初级与次级切割的位置，用FokⅠ-接合体复合物及参考的EcoRⅠ酶(如在图3中所显示的该酶在M13mp7发夹内切割)两者来切割M13mp7 SS DNA。在第8及第9道(图6)显示的结果看来似与在图3中显示的FokⅠ切割的位置相一致。在位点Ⅰ上的裂解是位于14-核苷酸靶序列(核苷酸6938-6951;图2)之内，而在位点Ⅱ上的裂解看来发生在由下裂核苷酸顺序所表示并由小圆点所指示的，其位置在接合体与M13 SS DNA之间完全相对应的9-核苷酸上(核苷酸1340-1348)。
向上的箭头表示由34-核苷酸接合体引导在SS DNA中切割。由左边32-核苷酸接合体引导的裂解应该在9-核苷酸同系列相应的右边边缘上(图2)，与较低产量的次级切割相一致(图6的第5及6道)。(其数目的最后数字与相应的核苷酸相适应)。
实施例Ⅲ本例说明裂解反应的各种条件。
(a)使用预制的酶-接合体复合物裂解在实施例Ⅱ中所说的方法，在加入FokⅠ前，将接合体与M13mp7 DNA退火。在此先用接合体使酶饱和并紧接着使之与靶M13mp7 SS DNA反应。
因而，当接合体过量时，游离的接合体分子就会结合到M13 SS靶DNA上并干扰酶-接合体复合物的切割。另一方面，当酶过量时，由于游离的酶不能识别SS靶DNA，则此种竞争将不会发生。
因此，增加FokⅠ的浓度及应用一个恒定数量的接合体以预制酶-接合体复合物如下在图7A中第1道相当于未处理的M13环状SS DNA对照物(如在图6的第1道)。为了使第2-4道，不同数量的FokⅠ(分别为12，24及36单位)与34-单体(数量与在图5中的相同;在70℃变性5分钟)相结合并在37℃在20微升的FokⅠ缓冲液中温育10分钟。向每一个酶接合体制剂中加入2微克M13mp17环SS DNA，在总体积为30微升中，在37℃进行消化1小时。其他步骤与在图6中者相同。
(b)缓冲液中KCl与Mg艹浓度的效应图7B的第1及2道相当于图6中第1及6道。第3-6道相当于第2道中下述实验的变体在第3及4道中，分别将FokⅠ缓冲液稀释2倍及4倍，两者都用作杂化及消化。在第5及6道中，从FokⅠ缓冲液中除去所有KCl。而且，在第6道中将Mg艹浓度降低4倍(从10到2.5毫克分子氯化镁)。
(c)DNA-接合体杂化作用的时限效应图7C的第1及2道相应于B板的第1及2道。第3-5道相应于第2道，但是M13 SS DNA-接合体(34-单体)杂化作用的时间却分别减至30，15及5分钟。第6道(SS的大小标准)代表变性的及在碱性样品混合物中电泳的质粒pRHP233的SS DNA片段。片段的大小(从顶端计)是3636、3097、2459、2443核苷酸，跟着的是分别为1700及1159核苷酸的二联体(互补的链)。(A)、(B)及(C)板代表在不同的日子进行的分开的实验。
如在图7A中所示，这些复合物裂解M13 SS DNA，并如上文所预期的，这种裂解在增加FokⅠ/接合体的比例时是很有效的(第2-4道)。它也表明应用预制成的酶-接合体复合物，以次级切割的比例来说其效果不大(在图3中切割Ⅱ)。
在实施例Ⅱ及Ⅲ中所讨论的所有反应，是在含有20毫克分子KCl，10毫克分子三-盐酸缓冲液，10毫克分子氯化镁及0.5毫克分子二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中进行的。对退火的条件作了较严格的探索，即在降低盐浓度的条件下，测定是否可降低次级切割的比例，而同时又使裂解的效率基本上不受影响。如在图7B中所示(第3及第4道)，2倍或4倍稀释的缓冲液，仍可使反应继续进行，同时初级与次级切割的比例看来只有轻微的增加。甚至完全消除KCl的组份导致有选择性的与有效的裂解(第5道)。在KCl及2.5毫克分子的二氯化镁不存在的条件下，可得到最有选择性的裂解作用(第6道)。
在加入FokⅠ酶之前，在37℃于接合体与靶M13mp7 SS DNA之间退火的标准时间为1小时。如图7C所示，退火的时间可降低至5分钟，而消化的样品几乎没有任何的变化。
实施例Ⅳ本例叙述应用酶-接合体复合物制备双股DNA片段。可将含有5′双股发夹区域及3′SS区域(图1及图2b)的接合体DNA用作合成互补的DNA链的引物。应用SS M13mp7模板，将接合体连接到位点Ⅰ及Ⅱ上(图3)使该接合体退火。加入PolⅠK(大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段)及所有四个dNTP′S，于FokⅠ缓冲液中，在20℃使DNA合成作用进行0.5-2小时。在互补的DNA合成作用开始之后5分钟或反应的末尾加入FokⅠ酶。在两种情况下可生成两种新的DNA片段，并在位点Ⅰ(1341)及位点Ⅱ(6938)上开始并切割(见图3及8)。新片段的长度为1116碱基对及603碱基对，因为它们也是在核苷酸225及6335(图8)上固定的FokⅠ位点被切割的。M13mp7的双股RF形式的消化作用仅生成3335，2775，910及218碱基对长度的四个片段(图8)。因此，1116-碱基对及603-碱基对片段是新的并由接合体-FokⅠ复合物的新的酶活性而生成。1116碱基对的片段的产率高，因为在接合体与M13mp7如DNA的位点Ⅰ(核苷酸1341)之间是完全相配的。603碱基对片段的产率较低，因为结合体的14个核苷酸中仅有9个在位点Ⅱ上配对(图3及8);但是，即使该结合体的3′-末端核苷酸没有被配对，但PolⅠK能使用仅以9个碱基对相配的这个引物。所生成的各个新DNA片段(带有由于PolⅠK反应而产生的钝末端)其钝末端被无性繁殖到M13mp17载体中并将它们的末端定序。通常，该序列与新的末端预测的序列相配对。这种具有一个预定的末端的双股DNA片段的制备方法看来是既简单又可靠的。片段的另一末端可以在FokⅠ位点上(图8)，或在由挑选出的其他限制性酶产生的任何其他末端上。
权利要求
1.一种能在靶DNA的一个预定的位点上裂解该DNA的通用的核酸内切限制酶，它包括(a)一种寡脱氧核糖核苷酸接合体；及(b)一种适当的限制性酶。
2.权利要求
1的通用的核酸内切限制酶，其中寡脱氧核苷酸接合体及限制性酶是以共价相结合。
3.权利要求
1的通用的核酸内切限制酶，其中寡脱氧核苷酸接合体仿制存在于限制性酶上的识别位点与裂解位点之间的关系。
4.权利要求
1的通用的核酸内切限制酶，其中限制性酶是由BbyⅠ，BbvⅡ，BinⅠ，FokⅠ，HgaⅠ，HphⅠ，MboⅡ，MnlⅠ，SfaNⅠ，TagⅡ或Tth111Ⅱ的酶组中选择出的一种类-Ⅱ酶。
5.权利要求
4的通用的核酸内切限制酶，其中限制性酶是FokⅠ。
6.权利要求
4的通用的限制性酶，其中寡脱氧核苷酸接合体含有一种与限制性酶的识别位点相关的双股核苷酸序列以及一种与靶DNA的预定的位点互补的单股核苷酸序列。
7.权利要求
1的通用的核酸内切限制酶，其中限制性酶是从EcoP1，EcoP15，HineⅠ或HinfⅢ的酶组中选出的一种类-Ⅲ酶。
8.权利要求
7的通用的限制性酶，其中寡脱氧核苷酸接合体包含一种与限制性酶的识别位点相关的双股核苷酸序列以及一种与靶DNA预定的位点互补的单股核苷酸序裂。
9.一种在一个预定的位点上裂解靶DNA的方法，包括使靶DNA与改变了的核酸内切限制酶相连接。
10.权利要求
9的方法，其中改变了的核酸内切限制酶包括(a)一种寡脱氧核苷酸接合体;及(b)一种适当的限制性酶。
11.权利要求
10的方法，其中寡核苷酸结合体与限制性酶是以共价相结合。
12.权利要求
10的方法，其中寡核苷酸结合体包含一种与限制性酶识别位点相关的双股核苷酸序列及一种与靶DNA的预定位点互补的单股核苷酸序列。
13.权利要求
10的方法，其中改变了的核酸内切限制酶与靶DNA相连接包括(a)将寡脱氧核苷酸接合体复合到靶DNA的预定位点上;及(b)将适当的限制性酶加到DNA-接合体复合物中。
14.权利要求
13的方法，其中靶DNA是单股的。
15.权利要求
14的方法，包括进一步在加入适当的限制性酶之前沿着单股靶DNA延长寡脱氧核苷酸接合体的3′-OH末端，以形成含有预定切割点的双股DNA的方法。
16.权利要求
10的方法，其中寡脱氧核苷酸接合体与限制性酶相复合，而其连接包括酶-接合体复合物与靶DNA相复合。
17.权利要求
16的方法，其中靶DNA是单股的。
18.权利要求
17的方法，包括进一步将寡脱氧核苷酸的3-OH末端沿着单股DNA延长以形成含有预定的切割位点的一种双股DNA，然后此种双股DNA被酶接合体复合物的适当的限制性酶切割。
专利摘要
一种用于在一个预定的位点上裂解一种靶DNA的通用的核酸内切限制酶。该通用的核酸内切限制利用一种裁剪了的、与一种限制性酶相连接的寡脱氧核苷酸结合体，使该酶可在距DNA识别位点上的一个已知的距离处切割DNA。该寡脱氧核苷酸接合体仿制存在于此种酶上的识别位点与切割位点之间的关系。
文档编号C12N15/09GK87100610SQ87100610
公开日1987年9月9日 申请日期1987年2月5日
发明者瓦克劳·西巴尔斯基 申请人:瓦克劳·西巴尔斯基导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan