Dna和它的应用的制作方法

专利名称:Dna和它的应用的制作方法
本发明涉及生产肌苷的方法。肌苷是合成5′-肌苷酸时作为起始材料的重要物质。本发明还涉及生产肌苷酸的新微生物及组建这些新微生物所用的新DNA。
人们已知发酵生产肌苷酸是用一种芽孢杆菌(见日本公告专利号2965/1980，41915/1982，42895/1984)，Brevibacterium(日本公告专利5075/1976，见农业生物化学1978年42期399页)或需要腺嘌呤及既需腺嘌呤又具几种药物抗性的类似菌株。用这些菌株是由于它们生物合成嘌呤核苷酸的能力都很强。
另一方面，用肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株可大量积累肌苷，因为当肌苷酸脱氢酶缺乏时，生产肌苷的一种中间体5′-肌苷酸就可有效地转化为肌苷，而不转化为5′-乌苷酸。为此目的，就常用影印法或用诸如紫外线和亚硝基胍(NTG)处理的突变方法筛选需要黄嘌呤或乌嘌呤的菌株。
然而这样得到的营养缺陷型菌株有很多缺点，例如由于它们在有关酶的基因以外其它区域的突变，产率会低于它们的母株，也会在发酵期间由于回复突变而使产率浮动。
根据这种情况，本发明人研究了如何得到肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株，结果用重组DNA技术将为肌苷酸脱氢酶编码的基因DNA并入一个来自该基因外的合适的DNA片段，构建出具有这种染色体DNA结构的新的微生物。本发明人发现用这种技术从受体微生物中诱变的新微生物是选自需要腺嘌呤的芽孢杆菌，它们可重复使用于高效稳定地生产肌苷。因为它们可大量积累肌苷，而在发醇过程肌苷脱氢酶活性的回复突变率又低于可观测的标准。本发明正是基于这个发现而完成的。
因此，本发明包括1.为钝化(失活的)肌苷酸脱氢酶编码的DNA，它与芽孢杆菌的肌苷酸脉氢酶基因及/或它的两侧区是同质的。
2.上述(1)定义的DNA，它具有插入某一DNA片段的肌苷酸脱氢酶基因区，从而得到所说的失活的基因。
3.如上述(2)定义的DNA，其中的DNA片段是除肌苷酸脱氢酶以外的其它基因。
4.如上述(3)定义的DNA，其中所说的其它基因是选择标记基因。
5.如上述(1)定义的DNA，其中所说的DNA删去肌苷脱氢酶完整基因或它的一部分。
6.含有上述〔1〕，(2)，(3)，(4)或(5)所定义的载体。
7.用上述(1)-(5)定义的DNA或(6)定义的载体转化的芽孢杆菌。
8.生产肌苷的方法，包括在培养基中培养肌苷酸脱氢酶缺陷型的芽孢杆菌，该菌是用为失活的肌苷酸脱氢酶编码DNA转化的，该DNA是与肌苷酸脱氢酶基因区和/或它的两侧区同质的，该菌也可是用插入该DNA的载体转化的，所以该菌可生产肌苷，并可收集培养液中生产出的肌苷。
为得到本发明所用含肌苷脱氢酶基因的DNA，用常规方法，即用限制性内切酶从微生物染色体DNA中将其切下，例如可根据日本公告专利156388/1985及相应的欧洲专利0151341的方法分离和克隆DNA。在这种情况下，DNA既含为肌苷酸脱氢酶编码DNA，又含少量两侧部分的DNA;然而，含有部分肌苷酸脱氢酶基因的DNA或既含部分该基因又含两侧基因的DNA都可应用。
根据上述定义，任何提及的DNA均可用做肌苷酸脱氢酶的整个区，只要该区为一个长1.85千对碱基的XbaⅠ-HincⅡ片段。
作为肌苷酸脱氢酶给体，原则上可用任何的微生物，只要它的肌苷酸脱氢酶区碱基序列与受体芽孢杆菌菌株的该酶编码DNA序列是高度同质的。从操作的角度最好用芽孢杆菌的，因为它自我无性繁殖，得到的转化体稳定。给体不一定必需是能生产肌苷，乌苷、黄苷或它们相应碱的菌株。但所用菌株必须不是肌苷酸脱氢酶缺陷型的。可用作给体芽孢杆菌菌株的例子诸如枯草杆菌，短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，具体可提及下列已知菌株枯草杆菌NA-6011(IFO14189.FERMBP-291)枯草杆菌NA-6102(IFO14190，FERM BP-292)枯草杆菌NA-7821(IFO14368，FERMBP-618)枯草杆菌NA-6128(IFO14373，FERMBP-617)枯草杆菌NO-115(IFO14187)
枯草杆菌NO168(BGSC NoIAI)枯草杆菌MI114(基因124，255〔1983年〕)短小芽孢杆菌(FERMP-2116)短小芽孢杆菌(FERMP-4832)短小芽孢杆菌(FERMP-4829)地衣芽孢杆菌ATCC8480地衣芽孢杆菌IFO12485BGSC;芽孢杆菌遗传物质贮存中心IFO;大阪，发酵研究所FERMP;国际贸易与工业部，工业科技司，发酵研究所(FRI)。
FERMBR;FRI是布达佩斯条约指定贮存单位的编号。
此外，来自芽孢杆菌已克隆的肌苷酸脱氢酶基因当然可用着本发明DNA的给体。将枯草杆菌NA-6012肌苷酸脱氢酶基因插入PBR322，经过克隆得到的PE×117就是一例。(日本公告专利156388/1985)。
PE×117可从大肠杆菌PE×117，用“分子克隆实验室手册”的方法萃取。(T.Maniatis等人，冷泉港实验室，于1982年由University of Tokyo Press出版，86-93页)。
为组建和分离本发明的DNA，用重组DNA技术是很方便的，EK系统适用于宿主-载体系统。可用作宿主的菌株包括由大肠杆菌K-12衍生的菌株如;大肠杆菌C600(见“分子克隆”504页)，大肠杆菌JA221(IFO14359)，和大肠杆菌294〔美国国家科学院学报1976年73卷4174页〕及从它们衍生的其它菌株〔如从C600衍生的大肠杆菌X-895(IFO14308，FERM BP-614)〕。可用的载体包括PBR322，PACYC184，PACYC177，PUC18，PUC19，PHSG396和PHSG298。
本发明的新DNA可用下述步骤从含肌苷酸脱氢酶基因的质粒中分离和组建。
用常规方法酶解含肌苷酸脱氢酶基因的质粒得到所需DNA，再将分别切下的DNA片段插入，如果需要的话可再用诸如蔗糖凝胶电泳方法萃取和分离各片段，将所需DNA与各片段混合，如果它们有同样粘性末端就直接用T4DNA连接酶将其连接在一起，如果没有相同粘性末端，就先将其粘性未端转化为平钝末端，再用T4DNA聚合酶使其连在一起。
酶解含肌苷酸脱氢酶质粒时，可用任何内切酶。只要它们在相关基因上有切点即可。但最好使用在相关基因有较少切点，在其它基因无切点的内切酶。如AflⅡ，APaⅠ，AXyⅠ，BamHⅠ，BClⅠ，BglⅡ，BstEⅡ，ClaⅠ，EcoRⅠ，Eco8IⅠ，HpaⅠ，HindⅢ，KpnⅠ，MluⅠ，NcoⅠ，PstⅠ，SacⅠ，SacⅡ，SalⅠ，SmaⅠ，SphⅠ，SplⅠ，SspⅠ，StuⅠ，XbaⅠ和XhoⅠ。
在本发明中，不管什么来源的DNA片段均可插入肌苷酸脱氢酶基因区，只要它可使该基因钝化，因此可包括原核生物和真核生物的DNA片段。在实际应用中含有选择标记的DNA片段最有用，因为它既可使肌苷酸脱氢酶钝化，又易于筛选转化体。
任何基因均可作为选择标记，只要它能在芽孢杆菌中表达，但最好选择也能在大肠杆菌中表达的基因。这种情况下，在芽孢杆菌及在大肠杆菌中的选择基因表达可能是“连续解读”型的(“read-through”)，因而所插入DNA片段并不总是需要在有关宿主中具有自身的表达启动子。
作为这种标记基因的例子。可提及药物抗性基因，氨基酸生物合成基因，核酸合成基因和维生素合成基因。药物合成基因诸如短小芽孢杆菌氯霉素乙酰转移酶基因〔D.M.Williams等人，Bacteriol。146，1162(1981)〕，质粒PC194氯霉素乙酰转移酶基因〔S.Horinouchi和B.Weisblum，J.Bacteriol，150，815(1982)〕和质粒PUB110卡那霉素mucleotid.yl转移酶基因〔M·Matsumura等人;J·Bacteriol;160，413(1984)〕。氨基酸合成基因可提及枯草杆菌亮氨酸基因〔T·Tan
a和K·Sakagachi;Molec，Gen，Genet，165，269(1978)〕和解淀粉芽孢杆菌色氨酸基因〔K·Yoshimura等人;J·Bacterial，159，905(1984)〕;核酸基因的例子已提及大肠杆菌胸腺嘧啶合成酶基因〔Rubin等人;Gene，10，277(1980)〕;作为维生素基因的例子可提到鼠二氢叶酸还原酶基因〔D.M.Williams等人;基因，16，199(1981)〕。
含有插入和钝化的肌苷酸脱氢酶基因的转化体可用下述方法很容易筛选出来。当DNA含有抗药基因时可在培养基中加有关抗生素筛选，当DNA含某一物质的合成基因作为标记时，可通过补充营养缺陷的办法筛选。
组建选择标记基因DNA片段如下述进行。
根据“分子克隆”164页-166页所述，先用合适的内切酶酶解含该基因的重组体，作琼脂糖凝胶电泳，分级分离出含该基因的一小块凝胶，用来分离该选择标记基因DNA。这时所用的内切酶在有关基因处无切点，选用的酶最好能切出尽量小的片段而又含有该基因。需要时可结合使用两种合适的内切酶。当所得的选择标记基因片段的任一端都不与它欲插入的含肌苷酸脱氢酶基因DNA片段的粘性末端吻合时，需先将其粘性末端转变为平钝末端后再连接。
本发明中删除部分或全部肌苷脱氢酶而具有该酶基因侧区的DNA可用下述方法获得。
用内切酶完全或部分酶解含肌苷酸脱氢酶的质粒，内切酶切点在该相关基因区。将其粘性末端转为平钝末端后再连接，即得到所需DNA，该侧部区DNA有0.05千对或更多对的碱基，最好距肌苷酸脱氢酶基因区5′端和3′端0.1到10千对碱基。
用一种在肌苷酸脱氢酶相关区有两个切点的内切酶来获得本发明DNA的步骤将进一步叙述。
用内切酶酶解含该相关基因的重组质粒，通过诸如加热等步骤钝化该酶，再用苯酚纯化DNA，用冷酒精沉淀DNA，用T4DNA连接酶再连接。
还可采用另外步骤先用内切酶酶解，然后用琼脂糖凝胶电泳将要删除的DNA片段从酶解产物中除去，用T4DNA连接酶连接剩余的DNA。从而用上述方法得到本发明的DNA。由于内切酶在为肌苷酸脱氢酶偏码的基因区有两个切点，该DNA删除一小段。
当本发明的DNA还可用在肌苷酸脱氢酶基因区有三个或更多个切点或除了相关基因区有切点外含肌苷酸脱氢酶基因区至少有一个切点的内切酶制取，用该酶部分酶解含它的质粒DNA后再连接，即可得到所需DNA。进而，也可用在肌苷酸脱氢酶基因区有唯一切点的内切酶制备本发明DNA，这种情况下，用这种酶先酶解DNA，如果酶解部分有粘性末端，再将酶解DNA的粘性末端转变为平钝末端，再连接，即可得到所需DNA。转变末端时或将粘性末端加一个核苷酸或除去一个核苷酸。也可用一对不同的内切酶酶解来删除肌苷酸脱氢酶基因区的一个片段，每种酶在该基因区都有各自的切点。
用如上述T4DNA连接酶的连接混合物转化宿主就可大量地得到新的DNA，转化体培养在对应插入选择标记的培养基上筛选，根据“分子克隆”86-93页所述方法进行筛选。
可用常规方法从转化体得到的质粒，分离插入标记的肌苷酸脱氢酶基因区。先用一种内切酶酶解质粒，再将其在琼脂糖凝胶电泳分离，然后电泳洗脱即可容易地萃取和分离出该基因区。
另一方面，也可根据上述方法用T4DNA连接酶的连接产物转化需要黄嘌呤的宿主菌株来大量制备删去部分或全部肌苷酸脱氢酶基因的DNA。转化体能生长在加上一种筛选药物和该宿主所需营养成分的基本培养基上，而不能生长在不含黄嘌呤的培养基上。
下面叙述用所得新DNA转化一种芽孢杆菌，组建一种新微生物的方法。
任何微生物都可用做转化受体，只要它能从细菌细胞外摄取线性DNA，而后将该DNA序列重组在与染色体DNA高度同质区中，使自己转化。所谓转化能力，并不是指受体必须与肌苷酸脱氢酶基因给体相同，只要它染色体DNA碱基序列与线性DNA所含肌苷酸脱氢酶基因显示高度的同质性即可。为得到具有高产率肌苷的转化体，所用芽孢杆菌，特别是枯草杆菌，短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌最好选用至少能积累一种诸如肌苷，乌苷和黄苷的含嘌呤物质的。它们需要具有转化能力，无病原性并且能安全地用于工业生产条件。
此外，用这样的一种微生物做为受体，假如它有一种或不少于二种已知的有利于积累嘌呤类物质的特性，(诸如抗嘌呤类似物，抗8-氮乌嘌呤，核苷磷酸化酶缺陷和抗叶酸桔抗物)。许多情况下都显示大大地改善肌苷的产率。
可用做受体的芽孢杆菌的例子如下枯草杆菌(B.G.S.C.N.IA3)枯草杆菌BM1032(IFO14559，FERE BP-1242;贮存于1986年12月25日)枯草杆菌NA-6011(IFO14189，FERM BP-291)枯草杆菌NA-6012(IFO14190，FERM BP-292)枯草杆菌NA-6128(IFO14373，FERM BP-617)枯草杆菌NA-7821(IFO14368，FERM BP-618)枯草杆菌ATCC19221枯草杆菌ATCC14662短小芽孢杆菌(FERM P-2116)短小芽孢杆菌(FERM P-4832)短小芽孢杆菌(FERM P-4829)地衣芽孢杆菌IFO 12485
转化芽孢杆菌时，本发明的新DNA可以完整质粒的形式应用，然而正常情况下，最好用线性DNA或从质粒上酶解下来的本发明的DNA。
可根据已发表的一种方法〔C，Anagnostopouls和J.Spizizen;J Bacteriol，81，741(1961)〕;用一线性DNA片段转化芽孢杆菌。所得转化体可从生长在对应选择标记的筛选培养基的菌落上取出。例如当插入一个药物抗性基因作为选择标记时，所得转化体可从含有关药物的培养基中筛选出来。可根据它是否能在含受体菌株生长必需物质的基本培养基和补充了黄嘌呤的基本培养基上生长来判断转化体是否成为肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株。
可用合适的内切酶酶解转化体的染色体DNA，在琼脂糖凝胶上电泳后将其片段转到硝酸纤维滤纸上，加碱变性，用含放射性物质分别标记用于插入的DNA片段，如含药物抗性基因的DNA片段，用这个DNA片段作探针进行Southern杂交。这样基于转化体染色体DNA具有与探针杂交片段，而受体染色体DNA没有，容易地判断转化体是否本发明所需的微生物。
根据用从给体分离的肌苷酸脱氢酶基因作探针进行Southtrn杂交时，转化体染色体DNA与该探针杂交的片段中插入的DNA片段的受体染色体DNA中的长，可证实转化体该DNA片段插入到肌苷酸脱氢酶基因中。同理，可用杂交法比较删除部分或全部肌苷酸脱氢酶基因的DNA转化的转化体中DNA片段的长度。
当上述转化体的标记基因为一个药物抗性基因时，根据标记基因的表达可证实转化体插入一标记基因到染色体DNA的肌苷酸脱氢酶基因区时具有了抗药性。由于插入了标记基因，它成为肌苷脱氢酶缺陷和需要黄嘌呤的菌株。而转化体的其它细菌学性质与转化前的受体没有什么区别。
上述转化体的另一特点是回复突变率低于可观察到的限度。
回复突变率可用在不含黄嘌呤的琼脂平皿上生长出的菌落与接种在平皿上的细胞数比值表示。然而，该转化体的回复突变率极低，在次级培养或用突变剂处理时几乎没有发生。
作为本发明转化体的例子有枯草杆菌BM1041(IFO14560;FERM BP-1243，贮存于1986年12月25日)，枯草杆菌NA-6141(IFO14561;FERM BP-1244，贮存于1986年12月25日)枯草杆菌BM-1403(IFO14655;FERM BP-1501，贮存于1987年10月7日)。
根据本说明书所述方法，可很容易地选择标记基因和受体来组建不同的转化体。
用本发明所得转化体生产肌苷，其方法与培养生产肌苷的微生物的常规方法相似，只是要在培养基中加入转化体所需的含黄嘌呤物质。
也就是说，培养基要含碳源，氮源和金属离子，诸如氨基酸，核酸和维生素都是必须的营养源。可用的碳源包括葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉，糖化淀粉溶液和糖蜜。可用的氮源，无机氮包括硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，碳酸铵，氨气和氨水，有机氮诸如蛋白栋，玉米浆，大豆粉，酵母和尿素，它们可单独使用也可结合使用。其它的营养成分如各种矿物质，氨基酸，维生素及细菌生长必需的类似维生素物质也可单独或结合地选择使用。可用做黄嘌呤的物质不仅包括黄嘌呤，黄苷，黄苷酸及其替代物乌嘌呤，乌苷，乌苷酸和核酸而且还包括含这些物质的微生物细胞及这些细胞的萃取物。可用做腺嘌呤的物质不仅包括腺嘌呤，腺苷、腺苷酸和核酸，也包括含这些物质的微生物细胞及这些细胞的萃取物。
有时还可加入硅油和聚乙二醇作为抗发泡剂或表面活性剂。
一般在通气条件下培养，如摇动培养和浸没通气培养。培养基PH范围最好为4-9。培养期间若PH浮动，可加硫酸，碳酸钙，氢氧化钠，氨气，氨水等将PH调至最优范围。适合所用微生物生长和肌苷积累的温度选自20-40℃间。培养细菌直至最大限度地积累肌苷，通常培养24-144小时可达到此目的。
用已发表的纯化方法如用沉淀法和用离子交换树脂或活性炭层析技术从培养液中分离纯化肌苷。
本发明的肌苷作为生产5′-肌苷酸的原料可高效地工业生产。用本发明的DNA转化能生产肌苷，黄苷和乌苷中至少一种物质的芽孢杆菌即可得到高肌苷产率的新肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株。由于它们没有回复突变，这些菌株能稳定高效地积累肌苷，从控制生产上看也是很有利的。
图1表示制备例子中所述PEX203的方法。图中P，Sm，X，S，B，H和E分别代表内切酶PstⅠ，SmaⅠ，XbaⅠ，SacⅡ，BamHI，HincⅡ，而EcoRI
意思是将SacⅡ和PstⅠ的粘性末端转变为平钝末端后用T4DNA聚合酶再连接。图中阴影部分表示肌苷酸脱氢酶区，深色线表示氯霉素乙酰转移酶基因区。
图2上部的图解分别表示枯草杆菌BM1032染色体DNA和枯草杆菌BM1041染色体DNA的结构;其中Sm，B，数字，阴影部分及深色线分别代表SmaⅠ切点，BglⅡ切点，碱基对数(Kbp)肌苷脱氢酶基因区和氯霉素乙酰转移酶基因区。图2下部的图A和图B分别表示枯草杆菌BM1032染色体DNA，BM1041染色体DNA与P32标记的PBTM124氯霉素乙酰转移酶基因DNA用SmaⅠ-BglⅡ双酶解产物杂交图及枯草杆菌BM1032和BM1041染色体DNA与P32标记的PEX117肌苷酸脱氢酶基因区用SmaⅠ-BglⅡ双酶解产物杂交图。
图3表示例5所述制备PEX181的方法。图中Ⅲ，X和P分别表示HindⅢ，XbaⅠ和PstⅠ。
下面用一些参考例和实施例进一步详述本发明，但本发明不为这些例子所限制。除特别说明外，参考例和实施例所述使用内切酶(所有内切酶均为Nippon Gene K·K生产)的反应均用酶生产者指定的条件下进行。
参考例1分离含枯草杆菌肌苷酸脱氢酶基因的质粒PEX117。
转化体E·ColiTEX117(日本公告专利号156388/1985)携带含枯草杆菌NA-6012(IFO14190，FERMBP-292)衍生的肌苷酸脱氢酶基因区的重组质粒PEX117。根据“分子克隆”86页-93页所述方法提取该质粒。即将E·coli TEX117接种到LB培养基(10克/升细菌用胰化胨，5克/升酵母萃取物，5克/升氯化钠)，加氯霉素使其浓度为140微克/毫升，培养一夜，然后收集并洗涤细胞。加溶菌酶溶解细胞，再加含1%SDS的0.2N氢氧化钠，0.5M醋酸钾，然后离心收集含该质粒的上清液。加上清液6倍体积的异丙醇沉淀质粒DNA，用酒精洗，再溶于TE缓冲液(10mM tris-Hcl，1mM EDTA，PH8.0)。加入氯化铯，调其比重至1.60，加溴化乙锭使其浓度为600微克/毫升。在20℃，50，000rpm(用V65Ti转头)离心12小时。在紫外光下可观察到质粒带。用n-丁醇除去溴化乙锭，在TE缓冲液中透析，300毫升培养液可得到约200微克PEX117质粒。用各种内切酶酶解该质粒。将酶解片段电泳带与用HindⅢ酶解的入噬菌体DNA电泳带分子量比较得到图1的该质粒酶切点图。PEX117是一个重组质粒，其中有约6.4千对碱基DNA片段插入到PBR322的PstⅠ切点。
用HindⅢ部分酶解3微克PEX117。用HindⅢ完全酶解PBR322。将其混合，用上述方法将其连接。再用这个DNA混液转化E·ColiX-895。得到四环素抗性菌株和不再需要黄嘌呤的转化体。再从它们中得到E·Coli TEX-147。从该转化体中获得220微克重组质粒。该质粒命名为PEX147。图3表示PEX147的酶切图，PEX147是从PBR322衍生的一个重组质粒，在HindⅢ点上插入一个2.9千对碱基的DNA。
参考例2分离含氯霉素乙酰转移酶的质粒PBTM124。根据Williams等人方法〔J·Bacteriol，146，1162(1981)〕制备该质粒。具体方法如下将6.5微克短小芽孢杆菌NCIB8600(IFC12089)的DNA用40单位的内切酶EcoRⅠ在37℃酶解1小时，在68℃加热15分钟，再用酒精沉淀。另一方面，将质粒PUB110(2.0微克)用20单位的EcoRⅠ在37℃下酶解1小时，在68℃加热15分钟，再用酒精沉淀。
将上述两种沉淀溶于水中，混合，取100微升，加60毫摩尔ATP，10个单位的T4DNA连接酶和连接缓冲液，在11℃下温育30小时，再用酒精沉淀，将沉淀溶于50微升TE缓冲液。取其25微升该悬液转化枯草杆菌MI-114〔Gene，24，255(1983)〕得到一个具氯霉素抗性的转化体。从该转化体制备的质粒，命名为PBTM124。它是重组质粒，其中有一个含氯霉素乙酰转移酶基因约2.1千对碱基的DNA片段插入PUB110的EcoRⅠ切点。
例1将30微克的PBTM124在37℃用内切酶EcoRⅠ和Pst酶解1小时，然后在琼脂糖凝胶中电泳，将相当1.1千对碱基DNA的电泳带切下。用单向电泳洗脱器(国际生物技术公司制造)将凝胶片段中的相关DNA萃取出来，用酒精沉淀，再将沉淀溶于10微升的TE缓冲液中。另一方面，将3微克PBX117用内切酶SacⅡ在37℃酶解1小时，再在65℃加热15分钟，用酒精沉淀，将沉淀溶于10微升TE缓冲液中，将上述两部分DNA液混合，加2毫摩尔dNTP和5个单位T4DNA聚合酶(Takara Shuzo 公司制造)，加入TA缓冲液(tris-醋酸为33mM，pH7.9，66mM醋酸钾，10mM醋酸镁，0.5mM二硫苏糖醇，0.01%牛清蛋白)在37℃反应20分钟，再在65℃加热15分钟。然后用苯酚萃取，再用酒精沉淀。将所得沉淀溶于TE缓冲液;加66毫摩尔ATP，200个单位T4DNA连接酶(Takara shuzo 公司制造)和连接酶缓冲液制备成30微升的反应混液，于16℃温育一天。取出5微升混液，将E·Coli×895(IFO14308，FERM BP-619)的感受态细胞转化，得到具氯霉素抗性的转化体E·ColiX895(PEX203)。转化是根据Cohen等人方法进行的。〔Pro Natl Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕。
根据参考例1的方法，从转化体E·ColiX895(PEX203)中提取质粒，命名为PEX203。用各种内切酶酶解PEX203，进行琼脂糖凝胶电泳，根据入噬菌体HindⅢ酶解产物电泳带分子量绘出其酶切点图(见图1)。
将100微克PEX203用内切酶PstⅠ酶解，用琼脂糖凝胶电泳，切下相当7.5千对碱基的DNA电泳带，用上述电泳洗脱器分离出35微克DNA。根据其内切酶谱证实该DNA是插在pBR322PstⅠ点上的7.5千对碱基对的片段，它在枯草杆菌肌苷酸脱氢酶基因区的SacⅡ上插入了一个短小芽孢杆菌NCIB 8600氯霉素乙酰转移酶的基因。制备PEX203的方法和它的内切酶切点图示在图1。
例2ⅰ)获得一个在肌苷酸脱氢酶基因区插入一个氯霉素乙酰转移酶的新芽孢杆菌菌株。
从枯草杆菌MI-114用常规步骤得到一个需要腺嘌呤的营养缺陷型枯草杆菌BM1032(IFO14559，FERM BP-1242)。
根据C·Anagnostpoulos和J·Spizizen的方法，制备该菌株的感受态细胞，将例1得到的7.5千对碱基的DNA片段加入到1毫升所述感受态细胞悬液，在37℃摇动1小时。将悬液倾入含10微克/毫升氯霉素的LB琼脂培养基中，在37℃温育1天;从长出的菌落得到具氯霉素抗性的转化菌株枯草杆菌BM1041(IFO14560，FERM BP-1234)。将上述转化体接种到M.9CATA培养基中(6克/升Na2HPO4，3克/升KH2PO4，0.5克/升Nacl，1克/升NH4cl，1mM MgSO4，1mMCacl22克/升葡萄糖，2克/升酪蛋白氨基酸，50毫克/升腺嘌呤，50毫克/升色氨酸，15克/升琼脂，PH7.2)，再向培养基中加入黄嘌呤，检验其生长物，证实该具氯霉素抗性的转化体也需要黄嘌呤，根据Magasanik的方法测定肌苷酸脱氢酶的活性(见Method in Enzymology VI，106到110)，在该菌株中没发现有该酶的活性。
(ⅱ)氯霉素乙酰转移酶基因插入到染色体的证据将枯草杆菌1041接种到LB培养基上，在28℃培养一夜，然后取1升培养液用苯酚萃取DNA〔Biochem，Biophys，Acta，72，619(1963)〕。取10微克染色体DNA，用内切酶BglⅡ和Sma双酶解，然后进行琼脂糖凝胶电泳，再用“分子克隆”382-386页所述方法将其转移到硝酸纤维滤纸上。同时将枯草杆菌BM-1032的染色体DNA也转到滤纸上，另一方面，用例1所述方法从pBTM124萃取和分离一个1.1千对碱基的DNA片段;用P32CTP标记该DNA片段，用它作为探针。用缺口转译盒-2(Nick Trans1 ation Kit-2由Nippon Gene公司生产)根据厂商说明书制备该探针。
根据“分子克隆”387-389页所述方法进行Southern杂交，杂交带出现在对应枯草杆菌BM-1041染色体DNA3.9千对碱基的泳带位置。
用XbaⅠ和HincⅡ双酶解30微克PEX117，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切下对应1.85千对碱基泳道的一小块凝胶，萃取出DNA，如上述缺口转译来使其标记。用这标记DNA作探针，以上述同样方法进行Southern杂交。杂交带出现在2.1千对碱基泳道对应的位置。而一个3千对碱基的DNA与枯草杆菌BM1032染色体DNA杂交时杂交带出现在2.1千对碱基DNA泳道对应位置，它与枯草杆菌BM1041杂交时，杂交带在对应3.9千对碱基位置。图2表示了这一结果。
ⅲ)枯草杆菌BM1041需要黄嘌呤型的回复突变将一接种环枯草杆菌BM1041接种到表1所述20毫升种子培养基中，在37℃摇动培养18小时。然后将1毫升培养液转到表1所述发酵培养基(20毫升)中，在37℃，摇动培养2天，再将1毫升所得培养液转到发酵培养基中在37℃摇动培养2天，这样重复转移5次，检查培养液中活细胞数，结果发现每1毫升培养液中有活细胞1×109，它们都需要黄嘌呤，没发现回复突变型。
另一方面，将所得转化体用常规方法诱导的需要黄嘌呤的枯草杆菌RN63(IFC14307，FERM BP-613)，重复上述步骤，结果是当1毫升培养液有1×109个活细胞时，20%(2×108)回复突变成不需黄嘌呤型。
表浓度(克/升)培养基成分 种子培养基 发酵培养基葡萄糖 30 140各氨酸钠 10 10硫酸铵 7.5尿素 3 10玉米浆 20 30硫酸镁 2 2腺嘌呤 0.2 0.075黄嘌呤 0.2 0.050磷酸氢二钾 21氯化钾 0.5氯化钙 2 5硫酸锰 0.0025碳酸钙 30pH 7.0 6.8ⅳ)枯草杆菌BM1041肌苷的产率将一接种环的枯草杆菌BM1041接种到1升含125毫升表1所示种子培养基的锥型瓶中，37℃下摇动培养12小时。将全部培养物转到一个5升含2.5升表1所示发酵培养基的瓶中，37℃下培养60小时，从起始培养的5-35小时以10微克/毫升。小时的速率连续喂入黄嘌呤，在起始培养的24小时加入100毫升含12.5%硫酸铵和6.25%尿素的混合液。完成培养后，用高效液相色谱测定肌苷和鸟苷的累积量，结果肌苷为10.1毫克/毫升。枯草杆菌BM1032在同样条件下培养，肌苷累积量只有5.2毫克/毫升。
例3根据例2方法制备枯草杆菌NA-6128(IFO14373 FERM BP-617)感受态细胞。将例1得到的7.5千对碱基的DNA片段加入感受态细胞。在37℃摇动1小时使其转化;从生长在含10微克/毫升氯霉素的LB培养基上的菌落得到抗氯霉素的转化体枯草杆菌NA-6141(IFO14561，FERM BP-1244)。
根据其在M-9CATA培养基及加有黄嘌呤的该培养基上是否能生长，确定该转化体需要黄嘌呤。
用例2所述同样方法进行Southern杂交，当用1.1千对碱基的PBTM124DNA片段作探针时，没有与枯草杆菌NA-6128染色体DNA杂交的杂交带。与枯草杆菌NA-6141染色体3.9千对碱基的SmaⅠ-BglⅡ片段有杂交带。此外，当用PEX117的1.85千对碱基的XbaⅠ-HindⅡ片段做探针时，枯草杆菌NA-6128在对应2.1千对碱基和3.0千对碱基的Smal-BglⅡ的DNA片段均有杂交带，枯草杆菌NA-6141的2.1千对碱基及3.9千对碱基的DNA片段也有杂交带。
例4将一接种环的枯草杆菌NA-6141接种到含125毫升表1所示种子培养基的1升容积的锥形瓶中。在37℃摇动培养12小时。将所有培养物转移到含2.5升表1所示发酵培养基的5升容积的瓶中，在37℃培养86小时，起始培养后5-35小时以10微克/毫升。小时的速率连续喂入黄嘌呤，起始培养后24小时和48小时加入100毫升含12.5%硫酸铵和6.25%尿素的混合液。用高效液相色谱测定培养液中累积的肌苷和鸟苷的量。结果发现以35.0毫克/毫升的比率累积肌苷。在同样条件下培养枯草杆菌NA-6128，它只以19.8毫克/毫升的比率累积肌苷。
检验上述培养液中的活细胞及回复突变的数目，活细胞为每毫升培养液含4×108个，结果发现有不需黄嘌呤的回复突变。也检验了需腺嘌呤的回复突变发生情况作为对照。结果每毫升培养液出现4×102个。从回复突变率也可看出本发明的效果是显而易见的。
例5ⅰ)用内切酶HindⅢ1个单位，部分水解3微克的PEX147 DNA，在65℃加热10分钟使酶失活，然后用冷酒精沉淀DNA。离心收集沉淀，将其溶在20微升TE缓冲液中，再用T4DNA连接酶再连接。根据例1所述方法用连接混合液转化E·Coli×895，将悬液转到含25微克/毫升氨苄青霉素和黄嘌呤的M-9CATA琼脂平皿内。在37℃温育一夜，将菌落转到另一个M-9CATA琼脂培养基中，连续温育24小时，检验每个平皿上生长物，筛选出抗氨苄青霉素又需黄嘌呤的转化体，命名为TEX181。从TEX181细胞分离质粒，命名为PEX181。质粒组建及内切酶点图见图3。
从图3可见，PEX181是删掉一个位于含肌苷酸脱氢酶基因区的插入DNA片段中央附近，约0.25千对碱基的HindⅢ片段的质粒，它不具有E·Colix895的需要黄嘌呤补偿能力。
ⅱ)将PstⅠ酶解的PEX181DNA5微克加入枯草杆菌BM1031的感受态细胞悬液，在37℃温育1小时。然后用无菌水稀释悬液，将其置入含黄嘌呤的M-9CATA琼脂平盘培养基。在37℃温育一夜，将平皿上形成的菌落转到M-9CATA琼脂培养基，温育24小时。基于在上述两种培养基上均能生长，可筛选出需要黄嘌呤的菌株，命名为枯草杆菌BM-1043(IFO14655，FERM BP-1501)，在该菌株中没观察到肌苷酸脱氢酶的活性。
ⅲ)将一接种环的枯草杆菌BM-1043接种到LB培养基中，在28℃温育一夜。从培养液收集细胞，用苯酚萃取，纯化其染色体DNA。将10微克所得DNA用BglⅡ和SmaⅠ酶解，将枯草杆菌BM1032染色体DNA的酶解片段也以上述方式转移到硝酸纤维滤纸。用例2-ⅱ制备的P32标记的XbaⅠ-HincⅡ片段作探针进行Southern杂交。结果枯草杆菌BM-1043染色体DNA中对应2.1和3.0千对碱基位置观察到杂交带。
ⅳ)根据例2-ⅲ)所述步骤检验枯草杆菌BM-1043需要黄嘌呤菌株的回复突变，结果没观察到回复突变体。
ⅴ)用例2-ⅳ)方法检验枯草杆菌BM-1043生产肌苷的情况，发现培养液中肌苷累积量为9.8毫克/毫升。
权利要求
1.为钝化(失活)的肌苷酸脱氢酶编码的DNA，它与枯草杆菌的肌苷酸脱氢酶基因区和/或它的侧部区高度同质。
2.根据权利要求
1所述DNA，该DNA具有插入一个DNA片段的肌苷酸脱氢酶基因区，从而使该基因钝化(失活)。
3.根据权利要求
2所述DNA，其中所述的DNA片段是一个除肌苷酸脱氢酶基因以外的其它基因。
4.根据权利要求
3所述DNA，其中所述的其它基因是一个筛选(选择)标记基因。
5.根据权利要求
4所述的DNA，其中所述的选择标记基因是选自下面一组的一个或多个基因药物抗性基因，氨基酸合成基因，核酸合成基因和维生素合成基因。
6.根据权利要求
5所述DNA，其中所述的药物抗性基因是氯霉素乙酰转移酶基因。
7.根据权利要求
1所述DNA，其中所述DNA是一个删去部分或全部肌苷酸脱氢酶基因区的一段DNA。
8.插入权利要求
1所述DNA的质粒。
9.用权利要求
1所述DNA转化的芽孢杆菌菌株。
10.用权利要求
8所述质粒转化的芽孢杆菌菌株。
11.生产肌苷的方法，包括在一个培养基中培养一个肌苷酸脱氢酶缺陷型的芽孢杆菌菌株，该菌株是用与肌苷酸脱氢酶基因区和/或它的侧部区高度同质的，为钝化的肌苷酸脱氢酶编码的DNA或插入该DNA的质粒转化的，该菌株能生产肌苷，然后在培养液中回收生产的肌苷。
专利摘要
用重组DNA技术生产与肌苷酸脱氢酶基因区和/或它的侧部区高度同质的DNA，它使该基因钝化。该DNA及插入该DNA的载体可用来转化芽孢杆菌，从而使这些菌株至少能生产肌苷，黄苷和鸟苷中的一种核苷。生产肌苷的该菌株既能高度累积肌苷又很稳定。
文档编号C12N15/09GK87101275SQ87101275
公开日1988年8月10日 申请日期1987年12月25日
发明者宫川权一郎, 木村宏之, 隅野靖弘 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan