Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Wipl(wild-typep53_induced phosphatase)敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞（BoneMarrowMesenchymalStem Cells，BMMSCs)迀移中的应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新， 并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细 胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。间充质干细胞（MesenchymalStemCells，MSCs) 是干细胞的一个研宄分支，其具有自我更新，多向分化，免疫调节及寻靶等一系列优势，为 将来细胞治疗呈现出希望。BMMSCs来源于骨髓，可在体外培养扩增，并能在体外特定条件下 能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经元细胞等；同时具有迀移能力和免 疫调节功能，能有效的用于多功能的治疗。
[0003] 目前，关于MSCs用于治疗十余种难治性疾病的研宄已开始进行，其除了用来促进 恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病，肝 硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫 性疾病的治疗研宄，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。
[0004] 然而自体MSCs的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如个体间MSCs扩增能力差 异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要，其中 MSCs和其他原代细胞一样在体外培养过程中具有生长停滞，过早衰老等相似的情况。这些 制约了自体MSCs的使用。涉及到MSCs迀移到靶位置和生长停滞的一些调控因子及机制研 宄的不够深入，报道的较少。因此，深入解析MSCs增殖和迀移信号转导途径网络，探讨如何 增强MSCs向受损组织趋化和迀移的能力，可以为提高MSCs移植效率和应用提供新思路和 理论依据。
[0005] 细胞在增殖和迀移过程中都涉及到蛋白的磷酸化过程，Wipl是丝氨酸/苏氨酸磷 酸酶，由PPM1D基因编码。其主要表达于细胞核内，参与多条通路关键元件磷酸化/去磷酸 化的过程。目前研宄报道中，未见其参与MSCs迀移的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供敲除动物Wipl基因的物质的应用。
[0007] 本发明提供的敲除动物Wipl基因在制备具有如下（1)_(4)中至少一种功能的产 品中的应用：
[0008] (1)促进动物BMMSCs迀移；
[0009] ⑵抑制动物BMMSCs增殖；
[0010] (3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞；
[0011] (4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰；
[0012] Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0013] 上述应用中，所述促进动物BMMSCs迀移体现在提高动物BMMSCs的Racl活性、促 进PI3K/AKT表达和/或促进动物BMMSCs丝状伪足的形成；
[0014] 所述使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞体现在抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
[0015] 上述应用中，所述动物为小鼠。
[0016] 上述应用中，所述产品为药物。
[0017] 本发明另一个目的是提供敲除动物Wipl基因的物质的另一种应用。
[0018] 本发明提供的提供敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下A-D中至少一种功 能的产品中的应用：
[0019] A、提高动物BMMSCs中Racl活性；
[0020] B、促进PI3K/AKT表达；
[0021] C、促进动物BMMSCs丝状伪足的形成；
[0022] D、抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
[0023] 上述应用中，所述动物为小鼠。
[0024] 上述应用中，所述产品为药物。
[0025] 本发明实验证明，利用原代Wipr/_小鼠提取出来的原代BMMSCs经过细胞形态学 观察，分化能力鉴定，细胞表面特异标记识别鉴定，证明Wipl敲除可以促进小鼠BMMSCs迀 移。传统研宄方法利用以构建好的MSCs细胞系，在其基础上过表达或者干扰某基因来研宄 MSCs增殖停滞和迀移的分子机制。而本发明是利用敲除某基因的原代MSCs进行分子机制 研宄，相对传统而言，能做到既能完全排除细胞系本身所具备无限增长的影响，又能排除未 彻底清除某基因所保留部分生物学功能对机理研宄的影响。
[0026] 本发明所涉及的研宄手段包括：增殖检测，细胞周期检测，相关蛋白表达水平检测 (westernblot，免疫焚光），细胞核染，形态学观察，细胞划痕实验，transwell检测，相关蛋 白活性检测，涉及信号通路研宄（抑制剂，westernblot)，F-actin染色，激光共聚焦检测。 这些方法具有更加科学，严谨，可信度高的特点。
【附图说明】
[0027] 图1为PCR鉴定Wipl+鼠的凝胶电泳分析。
[0028] 图2为培养BMMSCs免疫表型和分化潜能的鉴定。
[0029] 图3为敲除Wipl使原代BMMSCs停滞于G2期。
[0030] 图4为敲除Wipl基因后降低cyclinBl蛋白表达。
[0031] 图5为Wipl-/-BMMSCs表现出生长停滞和早衰。
[0032] 图6为Wipl敲除后促进MSCs迀移愈合划痕。
[0033] 图7为Wipl敲除后促进MSCs通过transwell膜。
[0034] 图8为敲除Wipl后促进MSCs表达Racl活性。
[0035] 图9为敲除Wipl后促进MSCs表达AKT及促进AKT的磷酸化，从而增加MSCs迀移 能力。
[0036] 图10为Wipl敲除后促进MSCs肌动蛋白丝的重排及丝状伪足的形成。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] Wipl+/-小鼠（遗传背景：C57BL/6,与该遗传背景相比，仅Wipl基因为杂合型，一 条染色体有Wipl，另一条染色体上敲除Wipl;其余基因与C57BL/6 -致，为全身性敲除小 鼠）：中国医学科学院医学实验动物研宄所，Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0040] DNA组织样提取试剂盒：百泰克。
[0041] Racl-GTP Elisa试剂盒：Cytoskeleton, Inc.
[0042]FITC-CD34,FITC-CD45,APC-CD44,APC-CD29andPE-CD90 及同型对照：
[0043] e-Bioscience和MACS公司。
[0044]抗体Wipl(D4F7)，AKT,p-AKT(Ser473)，p-AKT(Thr308)，cyclinBl(4138p)，and
[0045]GAPDH(14C10):CellSignalingTechnology公司。
[0046] 5umtranswell膜和 60_mm培养皿：Costar公司
[0047] 油红、茜素红、DAPI染液：Sigma公司。
[0048] 罗丹明-鬼笔环肽：LifeTechnologies公司。
[0049]CellCountingKit_8 试剂盒：Dojingdo公司。
[0050] 基础培养基、血清、成骨、成脂分化试剂盒：Gibco公司
[0051] NSC23766、LY294002 :R&D公司。
[0052]CycleTESTPLUSDNA试剂盒：BDBiosciences公司。
[0053] 实施例l、Wipl_~j、鼠的鉴定及原代小鼠BMMSCs提取、鉴定
[0054]-、Wipl-A及Wipl-WT小鼠鉴定
[0055] 将Wipl+小鼠杂交，所产后代10周后剪尾、编号，提取DNA，经PCR鉴定扩增的带 型，所用引物如下：
[0056] 鉴定引物如下：
【主权项】
1. 敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下（1)-(4)中至少一种功能的产品中的应 用： (1) 促进动物BMMSCs迀移； (2) 抑制动物BMMSCs增殖； (3) 使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞； (4) 使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰； Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述促进动物BMMSCs迀移体现在提高动物BMMSCsRacl活性、促进PI3K/AKT表达和/ 或促进动物BMMSCs丝状伪足的形成； 所述使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞体现在抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述动物为小鼠。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。
5. 敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下A-D中至少一种功能的产品中的应用： A、 提高动物BMMSCs中Racl活性； B、 促进PI3K/AKT表达； C、 促进动物BMMSCs丝状伪足的形成； D、 抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述动物为小鼠。
7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。
【专利摘要】本发明公开了Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用。本发明提供了敲除动物Wip1的物质在制备具有如下(1)-(4)中至少一种功能的产品中的应用：(1)促进动物BMMSCs迁移；(2)抑制动物BMMSCs增殖；(3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞；(4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰。本发明实验证明，小鼠敲除Wip1后可以促进BMMSCs的迁移能力。
【IPC分类】C12N5-0775, C12Q1-02
【公开号】CN104531613
【申请号】CN201410654105
【发明人】牟玉莲, 李奎, 唐懿挺, 刘岚, 高倩, 魏景亮, 刘洋, 黄雷, 夏颖
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月17日