一种利用定点切割系统对猪h11位点定点插入的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用定点切割系统对猪H11位点定 点插入方法以及所设计的打靶载体。
【背景技术】
[0002] 已知在生物技术研宄中，将目的基因插入到染色体基因组中，可以采用同源重组 的办法或使用转座子的办法，但实践表明，同源重组的效率较低，操作麻烦，并且由于目的 基因的插入而使原有的基因遭受破坏；使用转座子的方法，也存在插入到染色体的部位是 随机的，而且使用的操作转座酶价格昂贵。
[0003] 因此，由于上述技术使用的局限性，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的 方式使外源基因随机插入猪基因组中，相应的使用该技术得到的重组体是后续的繁育与表 型分析非常繁琐。
[0004] 2010年，斯坦福大学的SimonHippenmeyer及其研宄团队在小鼠的第11号染色体 上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hippll位点，简称H11位点。H11位点 位于Eif4enifl与Drgl两个基因的间隙，与Eif4enifl基因的19号外显子和Drgl基因的 9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉 默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hippll位点定点基因修饰的小鼠与野生型小 鼠生长发育无区别。目前类似的还有R〇sa26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全 身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而H11位点则不存在类似的困难，由于其位于 两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特 异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hippll这样安全有效的基因修 饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。
[0005] ZFN和TALEN打靶技术是目前研宄较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技 术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特 异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异 位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供了一种借助定点切割系统对猪H11位点定点插入的方 法，以解决目前的技术随机插入、步骤繁琐、价格昂贵等缺陷。
[0007] 为实现上述目的，本发明所提供的方法包括以下步骤：1)设计被敲除基因的5'端 同源臂和3'端同源臂以及相应的通用引物；2)将上述同源臂、通用引物和/或欲插入的基 因引入到载体中，得到打靶载体；3)转染细胞；4)PCR扩增鉴定插入结果。
[0008] 其中，上述的5'端同源臂的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
[0009] 其中，上述的5'端同源臂的通用引物核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0010] 其中，上述的3'端同源臂的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
[0011] 其中，上述的3'端同源臂的通用引物核苷酸序列如序列表中序列4所示。
[0012] 其中，上述步骤4)中所用到的PCR扩增引物的核苷酸序列如序列表中序列5、序列 6、序列7、序列8、序列9、序列10所示。
[0013] 本发明的另一个目的是提供了一种打靶载体，该载体是依托CRISPR/Cas9打靶系 统所设计，它能够将外源基因精确的引入到猪的H11位点中，以解决传统打靶技术效率低 下，PCR检测引物不便设计，检测难度大的问题。
[0014] 为实现上述目的，本发明提供的打靶载体序列包括上述的5'端同源臂序列、5'端 同源臂通用引物序列、欲插入的基因序列、3'端同源臂通用引物序列、3'端同源臂序列。
[0015] 可进一步优化为，上述打靶载体还可以包括筛选元件Neo基因序列和/或DTA基 因序列。
[0016] 上述打靶载体中还可以不包含筛选元件。
[0017] 进一步的，其核苷酸序列如序列表中的序列11所示。
[0018] 本发明的再一个目的是将上述重组质粒应用到构建猪定点突变库的构建上。
[0019] 本发明提供的一种借助定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，实现了简 单、快捷、高效的基因定点插入。本发明依托切割系统对猪H11位点设计的打靶载体，它能 够将外源基因精确的引入到猪的HI1位点中，以解决传统打靶技术效率低下，PCR检测引物 不便设计，检测难度大的问题，且效率高，同时通过针对该位点设计的通用检测引物，使筛 选检测难度大大降低。
[0020] 此外通过实施例可知，所述打靶载体转染细胞，通过含有与正筛选基因相应药物 的培养基筛选阳性克隆，得到的阳性克隆富集效率高，细胞筛选方法简单，不需大量人力 物力，极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的成本，同时能让外源 基因稳定在H11表达，为转基因搭建了稳定的平台。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的打靶载体结构示意图；
[0022] 图2为PCR扩增鉴定结果图；以及
[0023] 图3A和图3B为阳性克隆的荧光激发图；其中图3A为可见光下的细胞显微观察 图，图3B为紫外光下的细胞显微观察图。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0025] 如【背景技术】中所提到的，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外 源基因随机插入猪基因组中，为后续分析带来个麻烦，为了克服上述缺陷，在本发明一种典 型的实施方式中，提供了一种借助定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，该方法的 关键之处是依据切割系统对猪H11位点设计了一种打靶载体，该打靶载体是将两端连有被 敲除基因的同源臂以及相应通用引物的欲插入基因引入到PLHG-4中获得的。上述的同源 臂是依据要敲出的基因设计得到的，其中5'端同源臂的序列如序列表中的序列1所示，相 应的通用引物序列如序列表中的序列2所示；3'端同源臂的序列如序列表中的序列3所示， 相应的通用引物序列如序列表中的序列4所示。将上述同源臂分别插入到载体PLHG-4中， 得到打靶载体，该打靶载体中还含有筛选元件Neo基因序列和/或DTA基因序列。将上述 打靶载体转染细胞即可得到重组细胞，利用该方法构建定点基因突变库时我们只需要将我 们感兴趣的基因插入到同源臂间就可以完成我们欲插入基因的定点插入。
[0026] 上述方法获得的打靶载体中含有通用引物，大大降低了筛选检测的难度与工作 量。并且设计的两同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外 侧还具有负筛选基因。上述打靶载体转染细胞，通过含有与正筛选基因相应药物的培养基 筛选阳性克隆，得到的阳性克隆富集效率高，细胞筛选方法简单，不需大量人力物力，极 大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的成本，同时能让外源基因稳定 在H11表达，为转基因搭建了稳定的平台。下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益 效果。
[0027] 实施例1
[0028] 借助定点切割系统对猪H11位点定点插入绿色荧光蛋白的方法，包括如下步骤：
[0029] 1、打靶载体构建 [0030] (1)合成片段
[0031] 依据猪H11位点的DNA序列设计3'端同源臂（序列3所示）、相应的通用引物（序 列4所示）以及在两端分别加酶切位点：MluI(ACGCGT)与Fsel(GGCCGGCC)加入，合成片段 如下：
【主权项】
1. 一种利用定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)设计被敲除基因的5'端同源臂和3'端同源臂以及相应的通用引物；2)将上述同源臂、 通用引物和欲插入的基因引入到载体中，得到在打靶载体；3)转染细胞；4)PCR扩增鉴定插 入结果。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5'端同源臂的核苷酸序列如序列 表中的序列1所示。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的5'端同源臂的通用引物核苷 酸序列如序列表中序列2所示。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3'端同源臂的核苷酸序列如序列 表中的序列3所示。
5. 根据权利要求4所示的方法，其特征在于，所述的3'端同源臂的通用引物核苷酸序 列如序列表中序列4所示。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中所用到的PCR扩增引物的 核苷酸序列如序列表中序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10所示。
7. 通过权利要求1所述的方法得到的一种打靶载体。
8. 根据权利要求7所述的打靶载体，其特征在于，其序列包括上述的5'端同源臂通用 引物序列、5'端同源臂序列、欲插入的基因序列、3'端同源臂通用引物序列、3'端同源臂序 列。
9. 根据权利要求8所述的打靶载体，其特征在于，还包括筛选元件Neo基因序列和/或 DTA基因序列；或是不包括筛选元件的序列。
10. 根据权利要求8或9所述的打靶载体，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序 列11所示。
11. 权利要求8所示的打靶载体在构建猪定点突变库上的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种利用定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，该包括以下步骤：1)设计被敲除基因的5’端同源臂和3’端同源臂以及相应的通用引物；2)将上述同源臂、通用引物和欲插入的基因引入到载体中，得到打靶载体；3)转染细胞；4)PCR扩增鉴定插入结果。本发明主要是依托猪H11位点切割系统设计打靶载体，该载体它能够将外源基因精确的引入到猪的H11位点中，以解决传统打靶技术效率低下，PCR检测引物不便设计，检测难度大的问题。本发明提供的定点插入方法能让外源基因稳定在H11表达，为猪转基因搭建了稳定的平台。
【IPC分类】C12N15-63, C40B50-06, C12N15-11
【公开号】CN104531686
【申请号】CN201410699684
【发明人】李奎, 阮进学, 杨述林, 李和刚, 牟玉莲, 吴添文, 魏景亮, 徐奎, 黄雷, 周荣, 刘楠
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月27日