基于高通量测序构建人tcbr文库的多重pcr引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建人TCBR文库的多重PCR 引物，和利用该引物构建人TCBR文库的方法。
【背景技术】
[0002] 得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基 因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域已经被应用于T细 胞和B细胞受体的免疫组库测序。在获得性免疫中，T细胞和B细胞通过表面的T细胞受 体和B细胞受体特异性的识别抗原肽-主要组织相容性复合物（pMHC)进而启动免疫系统 活化。通过测序淋巴细胞受体的⑶R3免疫组库，确定T、B淋巴细胞中受体分子的组成，可 以用以评价免疫组库的多样性等特征参数，并进一步研究获得性免疫系统的应答发生过程 及其发生机制。T细胞受体（TCR)由alpha和beta两条肽链组成，分别由TCRA和TCRB基 因编码，同时由于beta链具有更复杂的内部组成因而能更好的反映TCR的组成状况。TCRB 基因的胚系基因由多个开放阅读框依次排列而成，可划分为TRBV，TRBD，TRBJ，TRBC四组片 段，在T淋巴细胞发育过程中通过体细胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的TCRB分 子，为TCR的多样性提供了分子遗传基础。在TRBD-TRBJ，TRBV-TRBD的连接处，由于非模版 核苷酸的随机插入与缺失，大大增加了TCR分子的多样性程度。而TCRB基因的互补决定区 3 (CDR3)刚好覆盖TRBV-Junction-TRBD-Junction-TRBJ区域，包括了TCRB基因几乎全部的 多样性信息，因此，对于T淋巴细胞TCRB基因CDR3区域的序列组成进行测序可以很好的反 映TCR免疫组库的组成及应答状况。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于高通量测序构建人TCBR文库的多重 PCR引物；本发明的目的之二在于提供利用所述多重PCR引物构建TCBR文库的方法。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0005] 1、基于高通量测序构建人TCBR文库的多重PCR引物，所述多重PCR引物如SEQID NO. 2?SEQIDNO. 43 所示。
[0006] 2、利用权利要求1所述多重PCR引物构建人TCBR文库的方法，先提取正常胃黏膜 组织、胃癌组织或外周血总RNA，然后反转合成cDNA，以SEQIDNO. 1所示序列为反转录引 物反转合成cDNA，再以合成的cDNA为模板，SEQIDN0. 2?SEQIDN0. 43所示序列为引物 进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得人TCBR文 库。
[0007] 优选的，所述多重PCR的扩增条件为：95°C预变性10min;95°C变性30s，59°C退火 90s，72°C延伸90s，循环35次；最后72°C后延伸10min。
[0008] 本发明的有益效果在于：本发明公开了构建人TCBR文库的多重PCR引物，该引物 能够扩增TCRB基因CDR3区多样性序列，构建人TCBR文库，本发明还建立了构建人TCRB基 因CDR3区测序文库的方法，实现了T细胞受体免疫组库的稳定检测，对进一步了解免疫组 库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。
【附图说明】
[0009] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0010] 图1为凝胶成像检测目的条带图（1 :DL2000 ;2、3 :人TCRB文库条带）。
[0011] 图2为人TCRB文库统计结果。
【具体实施方式】
[0012] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0013]实施例1、提取人组织中总RNA
[0014] 人组织中总RNA的提取方法，包括如下步骤：
[0015] a.取人正常胃黏膜组织、胃癌组织和外周血加入Trizol后吹打，室温静置5min， 直接提取RNA或放入-80°C冰箱冻存；
[0016]b.按每微升Trizol加入200ii1氯仿，颠倒混勻（30s)，室温放置3min，然后于 4°C、12000g离心 15min;
[0017]c.取水相，按每微升Trizol加入200ii1氯仿颠倒混勻（30s)，室温放置3min，然 后于4°C条件下12000g离心15min;
[0018] d.再取上层水相，按每微升Trizol加入0. 5ml异丙醇，颠倒混勻，室温放置 lOmin，然后于4°C条件下12000g离心lOmin，弃上清；
[0019] e.沉淀按每微升Trizol加入1ml体积分数为75%的乙醇，温和震荡，悬浮沉淀， 然后于4°C、8000g离心5min，吸去上清，沉淀于室温（18?25°C)晾干；
[0020] d.晾干后用无RNA酶水溶解，得RNA。
[0021] 将提取所得RNA用epoch测定RNA浓度和质量。检测结果显示，0D260/0D280在 1. 8?2. 0左右。
[0022] 再利用变性胶电泳检测28s，18s和5s。检测结果显示，条带明显，28s/18s在2. 0 左右。
[0023] 上述检测结果表明本实施例提取的RNA质量满足建库需求，能够用于后续建库。
[0024] 实施例2、逆转录和多重PCR
[0025] 将实施例1获得的总RNA样本分别进行逆转录，逆转录使用RevertAidFirst StrandcDNASysthesiskit,具体操作按试剂盒说明书进行，其反应体系为：总RNA0. 1? 5iig，浓度为 20pmol的反转录引物（5'-atctctgcttctgatggctca_3'（SEQIDN0.1))liiL， 加入DEPC处理水定容至12yL，然后将混合液在PCR仪中65°C孵育5min，然后迅速放入冰 中冰浴 5min，再加入 5Xreactionbuffer4uL，Ribolock?RNase抑制剂（20u/iiL) 1uL， ImMdNTPMix2iiL，revertAidTMM-MuLV反转录酶200u/iiLliiL，混匀后，离心，然后在 42°C条件下孵育lh，得第一链cDNA。
[0026] 根据T淋巴细胞受体Beta链（TCRB基因）体细胞重排、非模版随机插入缺失、体 细胞超突变和类型转换重组的规律，设计多重PCR引物，为方便测序在正向引物和反向引 物的上游添加的测序接头，具体引物如表1所示：
[0027] 表1、人TCBR文库的多重PCR引物
[0028]
【主权项】
1. 基于高通量测序构建人TCBR文库的多重PCR引物，其特征在于：所述多重PCR引物 如 SEQ ID NO. 2 ?SEQ ID NO. 47 所示。
2. 利用权利要求1所述多重PCR引物构建人TCBR文库的方法，其特征在于：先提取正 常胃黏膜组织、胃癌组织或外周血总RNA，然后以SEQ ID NO. 1所示序列为反转录引物反转 合成cDNA，再以合成的cDNA为模板，SEQ ID NO. 2?SEQ ID NO. 47所示序列为引物进行多 重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得人TCBR文库。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多重PCR的扩增条件为：95°C预变性 lOmin ;95°C变性 30s，59°C退火 90s，72°C延伸 90s，循环 35 次；最后 72°C后延伸 lOmin。
【专利摘要】本发明公开了基于高通量测序构建人TCBR文库的多重PCR引物和方法，其引物序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.47所示，该引物是根据T淋巴细胞受体Beta链体细胞重排的规律，设计，并在正向引物和反向引物的上游添加测序接头，该引物能高效扩增模板，能够用于构建免疫组库；本发明还公开了构建人TCBR文库的方法，该方法简单，能够快速构建人TCBR文库，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。
【IPC分类】C12Q1-68, C40B40-08, C12N15-11, C12N15-10, C12N15-12
【公开号】CN104531713
【申请号】CN201510027750
【发明人】贾罄竹, 万瑛, 陈钢, 于海礼, 关鹏, 张建阳
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月20日