一种优化的极端耐热木聚糖酶xynh编码基因及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因及其应用。【
背景技术：
】[0002]木聚糖是植物细胞壁中最主要的半纤维素，约占植物细胞干重的35%左右，是自然界中出纤维素之外含量最丰富的多糖。木聚糖是由木糖通过0-1，4-糖苷键聚合而成的主链和一些侧链基团共同构成的一类杂合多聚糖，作为一种丰富的生物质资源，在木聚糖酶的作用下可被降解为国际市场上急需的低聚木糖和木糖。然而自然界中很大一部分木聚糖酶尚未被有效利用，造成了该资源的很大浪费。[0003]微生物木聚糖酶（EC3.2.1.8)是重要的工业用酶，随机催化水解木聚糖内部的0-1，4-D-木糖苷键生成木寡糖。木寡糖作为底物可被其他木聚糖酶类进一步降解，如0-D-木糖苷酶、a-L_阿拉伯呋喃糖苷酶和D-葡萄糖醛酸酶等（KhandeparkerR,NumanMT.Bifunctionalxylanaseandtheirpotentialuseinbiotechnology.JIndMicrobiolbiotechnol2008,35:635-644.)。基于功能上初级和三级结构和模型的显著差异，木聚糖酶主要分类为糖苷水解酶类第10和11家族，然而在糖苷水解酶类第5、7、8、16、26、30、43、52和62家族的酶中也发现了具有水解木聚糖的活性（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html)(CollinsT,GerdayC,FellerG.Xylanase,xylanasefamiliesandextremophilicxylanases.FEMSMicrobiolRev2005,29:3-23.)。其中GH10家族木聚糖酶相对分子量较大（>30000)，结构复杂，通常有多个结构域组成，包含一个催化结构域(CatalysisDomain,⑶）是木聚糖酶主要组成部分，承担着木聚糖酶的水解特性。虽然他们在氨基酸数量和组成方面差异很大，但其催化结构在大小上都很接近，主要以a-螺旋和a-折叠片重复出现的结构，因为与TIM结构相近，属于一个家族，称为（a/0)8折叠结构，其中特定位置的谷氨酸和天冬氨酸对催化特性影响很大。该酶还含有非催化活性的结构域，如多糖底物结合域，热稳定结构域，以及多个催化结构域等，赋予该酶分解可溶性木聚糖，不可溶性木聚糖酶和其他底物等功能。[0004]木聚糖酶的应用起源于1980年在动物饲料加工中的使用，随之被逐渐应用于造纸、食品、制药、酿造、纺织和生物燃料等领域。目前该酶主要应用于制浆造纸，饲料和食品等行业，并在现代工业中的应用地位越来越明显。木聚糖酶是利用非淀粉质原料生产酒精过程中的关键酶之一。随着生物能源事业发展的需要，木聚糖酶势必应用于更广泛的领±或（FawziEM.HighlythermostablepurifiedxylanasefromRhizomucormieheiNRRL3169.AnnMicrobiol2010,60:363-368.)。在工业生产过程中，往往存在高温等极端环境，高温环境能加快酶促反应速度，提高液体物料的流动性能，防止有害微生物在过程中的生长繁殖等等。普通中温木聚糖酶在高温下会发生结构变化，从而大幅度地丧失活性。为防止这个热灭活过程，就需要添加一些化学物质等方法保护酶，这样不仅增加生产成本且对产品质量有不利影响。[0005]应用海栖热袍菌ThermotogamaritimaMSB8所生产的耐热木聚糖酶进行水解，能从根本上解决高温环境使加入的酶很快失活的问题。来源于细菌的木聚糖酶普遍比来源于真菌的木聚糖酶具有更尚的热稳定性，且毕赤酵母具有尚效分泌、正确折萱蛋白和极尚细胞浓度培养的潜能常作为大规模生产外源蛋白质的表达系统，将来源于细菌的木聚糖酶基因经序列优化后应用于可高密度培养的毕赤酵母，更适宜于工业化生产。[0006]来源于海栖热袍菌ThermotogamaritimaMSB8的木聚糖酶1VBR由具有较优良的酶学性质(WinterhalterC,Lieblff.Twoextremelythermostablexylanasesofthehyperthermophi1icbacteriumThermoyogamaritimaMSB8.ApplEnvironMicrobiol.1995,61(5):1810-1815.)，属于糖苷水解酶类第10家族，其基因大小为984bp，氨基酸序列大小为328aa，预测其分子量为40kDa，其将木聚糖主要分解为木二糖与木糖，结晶体三维结构和功能等也进行了深入分析研宄，并具有极端热稳定性，在广泛pH条件下均能维持较高酶活性。到目前为止，还没有利用海栖热袍菌ThermotogamaritimaMSB8生产木聚糖酶1VBR的相关报道。目前的相关研宄只局限于对该酶的基因分析和酶特性分析。原始的1VBR基因中含有多个EcoRI和BglII酶切位点，在利用基因工程技术构建毕赤酵母工程菌时，直接利用原始基因无法完成酶切和连接。该原始基因必须进行优化后方可构建成功毕赤酵母工程菌。[0007]将该酶基因序列优化后，在毕赤酵母表达系统中高效表达，并基于极端耐热的优良性质，可在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、酿造、纺织和医药等领域具有广阔的应用前景。【
发明内容】[0008]本发明的目的之一是提供一种优化的能够在毕赤酵母中高效分泌表达的一种优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因。[0009]本发明的再一目的是提供一种含有该优化的木聚糖酶基因的重组表达质粒。[0010]本发明的另一目的是提供一种产该优化木聚糖酶的毕赤酵母重组菌株。[0011]本发明的另一目的是提供所述优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因的应用。[0012]本发明的以上目的通过以下技术方案来实现：[0013]依据H3B中发表的来源于海栖热袍菌ThermotogamaritimaMSB8的木聚糖酶1VBR氨基酸序列（SEQIDNO.2)与ThermotogamaritimaMSB8基因组序列（CP007013.1:l，869,644bp)中预测木聚糖酶（EHA58720.1)的氨基酸序列相似性为100%，为了提高木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达效率，在不改变木聚糖酶1VBR氨基酸序列情况下，对该木聚糖酶基因序列进行序列重排与密码子优化并提高mRNA二级结构稳定性，同时消除基因序列中的EcoRI和BglII位点，获得优化的木聚糖酶XYNH基因（SEQIDNO.1)(优化位点有下划线）。[0014]SEQIDNO.1：[0015]【主权项】1.一种优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.包含权利要求1所述优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因的表达载体。3.包含权利要求1所述优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因的表达载体PPIC9K-XYNH。4.包含权利要求1所述优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因的的重组菌株。5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为重组大肠杆菌，或重组酵母。6.-种高效表达极端耐热木聚糖酶XYNH的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)用权利要求2所述表达载转化宿主菌株；(2)培养转化后的宿主菌株；(3)分离纯化木聚糖酶XYNH。7.权利要求1所述优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因用于表达热木聚糖酶XYNH的应用。【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种优化的极端耐热木聚糖酶XYNH编码基因及其应用，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明解决来源于细菌的极端耐热木聚糖酶基因在真核表达系统中因密码子偏爱性所导致的表达效率降低，提供了一种性质优良目前全球尚未被用于毕赤酵母表达的木聚糖酶XYNH。【IPC分类】C12N15-70,C12N15-81,C12N15-56,C12N9-42【公开号】CN104531732【申请号】CN201410657097【发明人】熊海容,詹志春,王亚伟,周樱,余天意【申请人】武汉新华扬生物股份有限公司【公开日】2015年4月22日【申请日】2014年11月18日