捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于寄生虫分子检测技术领域，具体涉及一种捻转血矛线虫的环介导等温 扩增检测试剂盒及检测方法。 技术背景
[0002] 捻转血矛线虫呈世界性分布，严重影响畜牧业的发展。捻转血矛线虫成虫寄生于 真胃，以虫体的前端刺入胃黏膜引起损伤，造成真胃炎症和出血；分泌毒素影响造血功能、 消化液的分泌紊乱和对饲料的消化吸收障碍，使病羊呈现营养不良等一系列的症状；有时 引起致死性的进行性贫血；可导致肝坏死和肝细胞脂肪变性，并有时伴发缺铁；常造成羊 的大量死亡，尤其是羔羊的死亡最为严重，对畜牧业造成极大经济损失（李国清，赵俊龙， 杨晓野等.兽医寄生虫学.中国农业大学出版社.2006:200-203.)。
[0003] 核糖体第一内转录间隔（ITS-1)和第二内转录间隔（ITS-2)是大家比较 公认的用于虫种鉴定的遗传标记，已应用于线虫虫种鉴定（Gasser,R.B.，Hu,M.，C hilton,N. ,Campbell,B. ,Jex,A. ,Otranto,D. ,Cafarchia,C. ,Beveridge,I. ,Zhu ,X. , 2006.Single-strandconformationpolymorphism(SSCP)fortheanalysisof geneticvariation.Nat.Protoc. 1, 3121 - 3128.Gasser,R.B. ,Bott,N.J. ,Chilton,N. B.,Hunt,P. ,Beveridge,I., 2008.Towardpractical,DNA-baseddiagnosticmethodsfor parasiticnematodesoflivestock-bionomicandbiotechnologicalimplications. Biotechnol.Adv. 26, 325 - 334.)D 2006 年，NathanJ.Bott等人设计针对拾转血矛 线虫ITS-2基因的特异性PCR引物来通过PCR的方法鉴别捻转血矛线虫（Nathan J.Bott. ,BronwynE.Campbell. ,IanBeveridge. ,NeilB.Chilton. ,DianneRees. ,Peter W.Hunt. ,RobinB.Gasser. , 2009.Acombinedmicroscopic-molecularmethodforthe diagnosisofstrongylidinfectionsinsheep.InternationalJournalforParasit ology. 39 (2009) : 1277 - 1287.)。
[0004] 基于分子水平对捻转血矛线虫ITS-2基因进行PCR扩增可以及时准确的进行病 原鉴别，但是普通PCR、多重PCR以及荧光定量PCR，都必须依赖昂贵的精密仪器，检测费用 高，对检测人员要求较高的技术等，无法在条件较差的基层实验室进行。环介导等温扩增 法（loopmediatedisothermalamplification，LAMP)可以在等温条件下高效、快速、高特 异、高灵敏地扩增靶序列。这种方法不需要特别的设备，只需要一台可以提供60°C恒温环 境的仪器（如水浴锅或便携式恒温电热器）。不仅大大降低了检测的费用，而且给临床应 用带来极大方便（Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amin 〇,N.，Hase,T. , 2000.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcids Res. 28,E63.)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒，该 试剂盒包括三对特异性引物，外引物F3 :5' -TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3' ；外引物B3 : 5' -AAGAACATCGTCGCCATACA-3' ；内引物FIP:5'-ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTG TCTITTAG-3' ；内引物BIP:5' -TCCCTGAATGATATGAACATGITTGTCACTATCTAAGTCAATC-3' ；促环 引物LF:5' -GITCTTGAACTGAAATGGGAA-3' ；促环引物LB:5' -ITGAGTGTACTCAGCGAATAIT-3'。
[0006] 本发明的目的在于提供一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测方法。该方法快 速、灵敏、特异而又简单实用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0008] 一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒，根据已报道的登录号为 X78803. 1的捻转血矛线虫ITS-2基因序列（见序列表SEQIDNO:1所示），设计三对特异 性引物：
【主权项】
1. 一种抢转血矛线虫的环介导等温扩增检测引物，包括外引物F3 : 5' -TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3' ；外引物 B3 ;5' -AAGAACATCGTCGCCATACA-3' ；内引物 FIP ; 5' -ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3' ；内引物 BIP ;5' -TCCCTGAATGAT ATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC-3' ；促环引物 LF ;5'-GTTCTTGAACTGAAATGGGAA-3' ；促 环引物 LB ;5' -TTGAGTGTACTCAGCGAATATT-3'。
2. -种抢转血矛线虫的环介导等温扩增检测方法，包括W下步骤： (1) 样品总DNA提取； (2) 环介导的等温扩增： 1) 建立环介导的等温扩增（LAM巧反应体系；2. 5yL 10倍体积的Bst DNA聚合酶缓冲 液，2mM MgCla，0. 8M甜菜碱，0. 4mM dNTPs，外引物F3和B3各0. 2 y M，内引物FIP和BIP各 0. 6yM，促环引物LF和LB各0. 28yM，8U BstDNA聚合酶，2yL DNA模板，用灭菌双蒸水补 齐至25 y L ;其中阳性对照为用单条成虫提取的抢转血矛线虫基因组DNA，阴性对照为灭菌 双蒸水； 2) 环介导的等温扩增反应；DNA经95°C预变性5min，向预变性的DNA中加入上述除DNA W外的反应体系中，再将其放置于63°C反应60min，然后于80°C作用lOmin后终止反应； 3) 扩增产物分析；采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物； 显色反应：将1000倍体积的巧光显色剂SYBR Green I进行10倍稀释，之后取2 y L 加入至25 uL的环介导等温扩增的最终产物中，在自然光下用肉眼观察扩增产物的显色情 况；若扩增产物变为黄绿色则为抢转血矛线虫阳性，若扩增产物为红栋色则为抢转血矛线 虫阴性； 琼脂糖凝胶电泳：取25 y L的环介导等温扩增的最终反应产物10 y以加入至含有 0. 5 y g/mL漠化己锭巧B)染料的2%的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成 相系统上成像观察扩增产物的图谱；扩增产物为由不同大小的区带组成的阶梯式图谱为抢 转血矛线虫阳性。
3. 权利要求1所述引物在制备抢转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒包括三对引物：F3：5'-TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3'；外引物B3：5'-AAGAACATCGTCGCCATACA-3'；内引物FIP：5'- ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'；内引物BIP：5'-TCCCTGAATGATATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC-3'；促环引物LF：5'-GTTCTTGAACTGAAATGGGAA-3'；促环引物LB：5'- TTGAGTGTACTCAGCGAATATT-3'。本发明试剂盒具备特异性强，灵敏度高的特点，对捻转血矛线虫的DNA检测限达到45.1 pg/ul。
【IPC分类】C12N15-11, C12R1-90, C12Q1-68
【公开号】CN104531892
【申请号】CN201510025191
【发明人】杨新, 胡敏, 冯汉利, 方瑞, 朱凯祥, 漆明伟, 张宗泽, 谭理, 雷卫强, 周艳琴, 赵俊龙
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月19日