一种eddp人工抗原的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种美沙酮代谢物（EDDP)人工抗原的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 美沙酮又名美散痛，属麻醉性镇痛药，它的化学结构和吗啡相差较远，但药理作用 却与吗啡非常相似。其突出的特点是镇痛作用强、口服有效，对阿片类毒品成瘾者的戒断症 状抑制作用持久，反复应用持续有效，适用于成瘾病人的脱毒治疗。
[0003] 美沙酮的代谢场所主要是在肝脏内，代谢途径为氮原子上的脱甲基作用，再经过 自我环化得到主要代谢物2-乙缩醛-1，5二甲基-3, 3-二苯基吡咯烷（EDDP)，结构式如下：
[0004]
【主权项】
1. 一种美沙酮代谢产物EDDP人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备EDDP人工半抗原： (a) 将二苯乙腈与2-氯-N，N-二甲基丙胺盐酸盐以摩尔比为1:1. 6加入150ml圆底烧 瓶中，100°C下搅拌反应6小时；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固 体产物I ;薄层层析：层析液为乙酸乙酯，产物Rf =〇. 5~0. 7 ; (b) 将产物I与氯甲酸-2, 2, 2-三氯乙酯以摩尔比为1. 16:1加入50ml三口圆底烧 瓶中，以甲苯为溶剂，ll〇°C下搅拌反应24hrs ;反应结束后，补加之前一半摩尔量的氯甲 酸-2, 2, 2-三氯乙酯，继续反应24hrs，加入适量甲酸，三乙胺，用去离子水分出有机相，水 相用乙醚萃取，得到的乙醚相分别用浓度为10%的稀盐酸、饱和氯化钠水溶液洗涤，经干 燥，过滤，将溶剂转干得产物II ;薄层层析：层析液为氯仿：甲醇：氨水=9ml:lml:0. 2ml，产 物 Rf =0· 8~0· 9 ; (c) 将产物II与98%的甲酸以摩尔比为1:8溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入锌粉，室 温下搅拌反应48小时，反应结束后过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，将滤液转干，得到的油状物 溶于适量氯仿中，并用适量10%氨水溶液洗涤，水相用氯仿萃取，合并氯仿相，经无水硫酸 镁干燥，过滤，转干，得到黄色油状物，将该黄色油状物用乙醚溶解，用浓度为10%的稀盐酸 萃取两次，合并水相，水相用乙醚洗涤后用氯仿萃取三次，合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥， 过滤，转干，得到黄色油状物III ;薄层层析：层析液为氯仿：甲醇：氨水=9ml:lml:0. 2ml，产 物 Rf =0· 5-0. 6 ; (d) 将黄色油状物III溶于适量浓度为10%的稀盐酸中，加热到110°C，加入35倍摩 尔量的亚硝酸钾，控制加料时间在30min左右，继续反应30min，再补加之前五分之一摩尔 量的浓度为10%的稀盐酸和一半摩尔量的亚硝酸钾，控制加料时间仍为30min，回流反应 30min ;反应结束后，冷却至室温，用适量乙醚萃取，合并乙醚相，经无水硫酸镁干燥，过滤， 转干得到黄色粉末状固体IV ;薄层层析：层析液为氯仿：甲醇：氨水=9ml:lml:0. 2ml，产物 Rf =0· 8_0· 9 ; (e) 将黄色粉末状固体IV与乙基锂以摩尔比为1:2溶于甲苯中，冰浴条件下反应Ihrs ; 缓慢升温至室温，室温下继续反应80min，反应结束后加入适量冰水，分出有机相，有机相用 适量去离子水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经干燥，过滤，转干得到黄色油状产物V ;薄层层 析：层析液为氯仿：甲醇：氨水=9ml: lml:0. 2ml，产物Rf =0. 6~0. 7 ; (f) 将油状产物V与丁二酸酐以1:1. 5摩尔比溶于二氯甲烷中，冰浴条件下加入5倍油 状产物V摩尔量的无水三氯化铝，等固体基本溶解后，转入35°C -40°C的油浴中回流反应 过夜；停止反应，将反应液转入冰浴中，加入适量去离子水和浓盐酸，然后用去离子水洗涤 3次，取有机相，将有机相直接转干，爬大板分离得到产物VI，薄层层析：层析液为氯仿：甲 醇：氨水=9ml: Iml: 0· 2ml，产物 Rf =0· 5 ; (2) 制备EDDP人工抗原： (g) 将牛丙种球蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的A液； (h) 将EDDP半抗原VI置于50ml尖底离心管中，按比例加入去离子水，溶清后，再加入 A液，振荡，静置，再加入与EDDP半抗原VI相同质量的EDCI( 1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐），间断性摇晃，室温下静置反应过夜得到人工抗原混合液；其中，反应比 例疋00?半抗原：去离子水：4液5001=8〇111〖：151111:51111:8〇11^; (i) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78. 3:4. 2:1溶于去 离子水中，制备钠离子浓度为〇. lmol/L的PBS缓冲液，pH为7. 2~7. 4 ; (j) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗 原：EDDP-牛丙种球蛋白。
【专利摘要】本发明提供了一种美沙酮代谢产物2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷（以下简称EDDP)人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以二苯乙腈和2-氯-N,N-二甲基丙胺盐酸盐为原料通过加成反应、酯化反应、环合反应、硝化反应及傅克反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备EDDP的人工抗原即EDDP-牛丙种球蛋白。所制备的EDDP人工抗原可进行动物免疫，取得相应的EDDP抗体，可用于各种美沙酮免疫分析法的研究，为美沙酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
【IPC分类】C07K1-107, C07D207-20, C07K14-47
【公开号】CN104558143
【申请号】CN201410828209
【发明人】徐建, 高飞, 邵越水
【申请人】杭州奥泰生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月26日