一种产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域的乳酸菌活菌制剂的制备方法，属于微生物应用领 域，可用于家禽畜牧业中饲用活菌制剂等微生态制剂的生产。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸， 因而得名。将益生乳酸菌添加到食品中不仅可以提高食品的营养价值，而且具有保健作用， 如促进蛋白质等营养物质的吸收，产生维生素 B族等大量有益物质，改善人体肠道功能，恢 复人体肠道内菌群平衡，增强人体免疫力，抗肿瘤、抗衰老，还具有降胆固醇、降血脂、降血 压等作用。目前市场上的乳酸菌制品主要包括酸乳，酸乳饮料，活菌制剂等。
[0003] 本专利涉及的一株产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL菌株，经过试验证实 其不仅对单增李斯特氏菌有很好的抑菌效果，而且耐受胃肠逆环境（耐受胆汁和胃酸），因 此可以顺利通过胃肠定殖于肠道中产生细菌素和乳酸，具有抑制某些腐败菌和致病菌的作 用。本专利将该菌株制备成活菌制剂作为生物添加剂应用于家禽养殖业，可以达到预防家 禽肠道疾病的目的。
[0004] 目前，国内专利有关各种活菌制剂的制备方法较多，例如北京市农林科学院 季海峰和苏布敦格日乐申请的"一种猪源植物乳杆菌植物亚种冻干制剂及其制备方 法"（CN200910082441.X)是植物乳杆菌植物亚种经扩培、离心、加入保护剂、真空干燥， 获得高存活率的植物乳杆菌植物亚种菌粉；黑龙江八一农垦大学于长青、钱丽丽和姚笛 申请的"含有活性物质的植物乳杆菌活菌制剂及其制备方法"（CN201010283999. 7)是 在植物乳杆菌活菌粉中加入低聚糖，制备一种可在温室稳定存放的活菌制剂；上海环伟 生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的"一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应 用"（ZL200810034746)是一种片球菌、酵母菌和芽孢杆菌复合微生物活菌制剂。但关于利 用产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL制备活菌制剂，并利用油菜籽蛋白胨作为替代 氮源，马铃薯浆作为基质保存生物制剂中活菌的方法国内外未见相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的 制备方法。
[0006] 所述方法中，植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)Zhang-LL，已于2012年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所）， 其保藏号为：CGMCC No. 6936。在MRS培养基中培养2d，菌株Zhang-LL菌体呈短杆状， 0. 5X1. 33?2. 0 μ m，单个，成对或呈短链状排列，不生芽孢，革兰氏阳性。
[0007] 所述方法中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活化2?3代后，将活化好的菌液以 2% (V/V，体积分数）的接种量接种至改良MRS液体培养基中，37°C培养12h，获得的培养液 备用。
[0008] 上述方法中，改良MRS液体培养基：胰蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母浸粉 5. 〇g，柠檬酸三铵2. 0g，葡萄糖20. 0g，吐温801. OmL，乙酸钠 5. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，硫酸镁 〇.58，硫酸锰0.258，水比，？册.5，121°〇灭菌151^11
[0009] 所述方法中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵培养基是在改良MRS培养基的基 础上进行氮源的替代及优化的。培养基和发酵条件优化采用单因素多水平和四因素三水平 [L 9(34)]正交试验，以测定发酵液活菌数为指标，分析并确定了高活菌数发酵液的优化的培 养基和发酵条件。最终确定氮源（501油菜籽蛋白胨）含量3.0%、发酵温度34°C、发酵液 pH 6. 5、发酵接种量7%为最优发酵培养条件。优化的植物乳杆菌植物亚种的发酵培养基 501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基由以下成分组成：501油菜籽蛋白胨30. 0g/L，朽1檬 酸三铵2. 0g/L，葡萄糖20. 0g/L，吐温801. 0mL/L，乙酸钠 5. 0g/L，磷酸氢二钾2. 0g/L，硫酸 镁 0· 5g/L，硫酸锰 0· 25g/L，ρΗ6· 5,121°C 灭菌 15min。
[0010] 所述方法中，应用上述优化后的发酵培养条件，利用5L全自动发酵罐进行高密度 发酵，将Zhang-LL菌株的扩大培养液按7% (V/V，体积分数）的接种量接种至发酵罐中，利 用发酵罐自动控温系统保证发酵温度为34°C，发酵过程中以流加15% (V/V，质量体积比浓 度）的灭菌似20)3溶液控制发酵液pH为6. 5,转速为150r/min的条件下发酵16h，获得发 酵液。
[0011] 上述方法中，5L全自动发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为 BI0F6005GBN。
[0012] 所述方法中，将5L发酵罐中的发酵液在4°C条件下，8000r/min离心10min，收集菌 泥。
[0013] 所述方法中，将收集得到的植物乳杆菌植物亚种菌泥与1/10原发酵液体积的马 铃薯浆混合，采用单因素多水平试验，确定植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的冻干保护剂组 合配方为（V/V，质量体积比浓度）：3%脱脂乳+2%谷氨酸钠，混合均匀后，得到浓缩发酵 剂。
[0014] 上述方法中，马铃薯浆是由新鲜的马铃薯去皮、切块、经九阳牌食物料理机打浆制 成的。
[0015] 所述方法中将浓缩发酵剂在-35°c冰箱中预冻13h至完全冻结状态，得到预冻发 酵剂，利用真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于冻干温度_55°C、真空度0. OSmBar的条件下，冻 干48h至完全干燥状态，得到冻干发酵剂。
[0016] 所述方法中，经过菌落计数，所得到的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液活菌 数可达10 1(lCFU/mL以上，冻干活菌制剂的活菌数可达10nCFU/g以上，菌株的存活率达到 60%以上。此种活菌制剂利用油菜籽蛋白胨全部替代改良MRS培养基配方中的氮源，即替 代了改良MRS培养基中的胰蛋白胨、牛肉膏及酵母浸粉，不仅降低了培养基的成本，而且还 明显增加了发酵液乳酸菌的活菌数量。因此，利用马铃薯浆作为保护基质可以进一步降低 活菌制剂的成本，为家禽生物饲料添加剂的生产和产业化提供新思路。
[0017] 上述方法得到的产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法及 其活菌制剂产品，以及专利菌种属于本发明保护范围。
【具体实施方式】
[0018] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0019] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量对体积的百分含量。
[0020] 实施例1、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂及其制备方法
[0021 ] 1、确定植物乳杆菌植物亚种低成本发酵培养基中的氮源
[0022] 在发酵温度37°C、发酵液接种量2 %、发酵时间16h、发酵液pH 6. 5的条件下，选取 发酵培养基为改良MRS培养基，分别用501油菜籽蛋白胨、502油菜籽蛋白胨、503油菜籽蛋 白胨替代改良MRS中的氮源，进行发酵试验，测定不同发酵培养基发酵液中Zhang-LL菌株 的活菌数量，以确定最适发酵培养基的氮源种类，试验结果见表1。
[0023] 表1氮源种类对发酵液Zhang-LL菌株活菌数的影响
[0024]
【主权项】
1. 植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang_LL CGMCC No. 6936〇
2. -种利用产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL制备活菌制剂的方法，其特征 在于：植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL 油 菜籽蛋白胨改良MRS发酵培养基由以下成分组成：501油菜籽蛋白胨30. Og/L，柠檬酸三 铵2. Og/L，葡萄糖20. Og/L，吐温801. OmL/L，乙酸钠5. Og/L，磷酸氢二钾2. Og/L，硫酸镁 〇. 5g/L，硫酸锰0. 25g/L ;将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL扩大培养液按7 %接种量移种 至油菜籽蛋白胨改良MRS发酵培养基中，利用5L全自动发酵罐进行高密度发酵，控制发 酵温度34°C，发酵液pH 6. 5,搅拌转速150r/min，发酵16h，得到发酵液；将发酵液于4°C、 8000r/min离心10min，收集得到菌泥；将菌泥与1/10原发酵液体积的马铃薯浆混合，再 加入3%脱脂乳和2%谷氨酸钠作为冻干保护剂，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将浓缩发 酵剂于-35°C冰箱中预冻13h后，利用真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于-55°C、真空度 0. 08mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，获得植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制 剂。
【专利摘要】本发明涉及一种产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法，属于微生物应用领域。本发明利用植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus？plantarum？subsp.plantarum)Zhang-LL？CGMCC？No.6936菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心、冻干保护剂的添加、预冻及冷冻干燥等工序制备活菌制剂。本发明首先选取油菜籽蛋白胨作为替代氮源，降低培养基成本的同时，优化了植物乳杆菌的培养条件，并利用5L全自动发酵罐进行高密度发酵，在优化后的低成本培养基及培养条件下，发酵液活菌数可达1010CFU/mL以上。本发明利用马铃薯浆作为冻干保护剂基质，确定冻干保护剂较优组合配方，使植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL存活率达到60％以上，活菌量可达1011CFU/g以上。本发明制备的活菌制剂原料价格低廉，活菌含量较高，可为家禽新型饲料添加剂的开发提供良好的基础，提供重大的经济价值。CGMCC No.693620121204
【IPC分类】C12R1-25, C12N1-20, A23K1-17, A23K1-18
【公开号】CN104560799
【申请号】CN201410816266
【发明人】张红星, 刘慧 , 谢远红, 于立娟, 金君华, 段慧霞, 熊利霞, 高秀芝
【申请人】北京北农红泽生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月25日