一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种燃料乙醇的生产方法，尤其是涉及一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法。
【背景技术】
[0002]乙醇是一种重要的工业原料，广泛应用于食品、化工、医药卫生和军事等领域，当前乙醇的生产原料主要为淀粉、糖类等粮食和经济农作物，包括玉米、小麦和甘蔗等；在当今世界面临能源需求不断增加而环境污染日益加重的严峻形势下，乙醇越来越多地成为补充汽油的液体燃料，但在耕地面积不足或有限的国家，这类乙醇的生产势必形成“与粮争地、与人争粮”的危险局面，用粮食或经济作物来解决能源问题显然是不可持续的。
[0003]纤维乙醇利用农业废弃物或者生产于边际性土地的第二代能源作物为原料，被视为可部分替代汽油的理想液体燃料，具有可再生和清洁能源双重优势，已成为许多国家新能源战略的重要发展方向，其产业化对社会的可持续发展有着重要意义。芒草(Miscanthus)作为第二代能源作物的代表，原产中国，已受到世界各国的青睐，其具有生物质产量大，纤维素含量高，而且具有耐寒、抗旱和耐盐碱贫瘠等特点，可在不适合粮食生产的边际性土地上大规模种植，为纤维素乙醇的生产提供优质原料。
[0004]纤维乙醇的转化涉及两个关键技术，即木质纤维材料的有效预处理和纤维素酶的优化利用。木质纤维原料中的木质素、半纤维素紧密地包裹着纤维素，形成复杂结构，因此需要对木质纤维素进行预处理来改变纤维素的天然结构，降低纤维素的结晶度和聚合度，从而有利于纤维素酶与底物的结合及水解。预处理工艺中试验较多的为稀酸或稀碱处理，如专利号200910250006中提到的使用添加酸、碱等化学物对秸杆进行高温预处理生产燃料乙醇方法。在纤维素酶的选择和使用方面，目前使用的纤维素酶大多购买于少数酶制剂公司。因此目前纤维乙醇的生产会存在以下问题:(1)对木质纤维素进行酸碱预处理不可避免地产生大量易造成环境污染的废液，以及抑制后续发酵的毒性物质，(2)纤维素酶的购买不仅大大地提高了生产成本，而且为优化酶解效率造成了困难。
【发明内容】
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，该方法具有无污染，酶解效率高，成本低的特点。
[0006]本发明采用以下技术方案:
一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)酵母种子液准备:将酿酒酵母接种于YEro平板，于35-37°C恒温培养箱培养2-3天，用接种针挑取一环接于酿酒酵母种子液体培养基中，于35-37°C，转速ISOrpm的恒温摇床中震荡培养12h，得到一级种子液，再转接入2L的二级种子培养罐中，35-37°C，转速180rpm，通气速率12h ；
(2)芒草预处理:将粗粉至l-2cm的芒草与自来水按1.5:10的比例混合后，放入高温高压水热反应釜中，加热至220-225°C，维持10-15min，降温后取出芒草，压榨脱水过滤；
(3)同步糖化发酵:在发酵罐中加入0.4%KH2P04，0.4% (NH4)2SO4,0.2%MgS04，1%酵母粉，0.02%MnS04，2.5g/L吐温-20，步骤(I)中的酵母种子液和步骤(2)中的芒草的同时按照每Ig预处理后的芒草加入20FPU的比例加入自产纤维素酶，在35-37°C下以150rpm的转速搅拌培养96h，发酵结束，测定发酵液中乙醇浓度。
[0007]其中，步骤(I)所用酵母为耐高温酿酒酵母。
[0008]步骤(3)中加入的纤维素酶是以芒草为底物自产的纤维素酶。
[0009]步骤(3)中加入15%预处理后的芒草，酿酒酵母种子接种量为10%。
[0010]本发明的优点是:芒草材料的无污染水热预处理方法，不添加任何酸碱等化合物，毒性物质少，设备要求简单；同时，利用以芒草为底物自产的纤维素酶，具有酶解效率高、成本低等特点。
【具体实施方式】
[0011]下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
[0012]实施例1:
Cl)耐高温酿酒酵母种子液准备:将耐高温酿酒酵母接种于YEro平板，于35°C恒温培养箱培养3d，待形成菌落后，用接种针挑取一环(约5X106个)，接于10mL耐高温酿酒酵母种子培养基中，于35°C，转速180rpm的恒温摇床中震荡培养12h，将培养好的一级种子液按10%接种量再转接入2L的二级种子培养罐中(装液量1L)，35-370C，转速180rpm，通气速率lvvm，扩培12h。耐高温酿酒酵母种子培养基组成:5%葡萄糖，0.4% KH2PO4,0.4% (NH4)2SO4,0.2% MgSO4,1% 酵母粉，0.02%MnS04，PH 值为 5.0 ；
(2)芒草预处理:将粗粉至l-2cm的芒草与自来水按1.5:10 (w/v)的比例混合后，放入水热反应釜中，加热至220°C，维持lOmin，降温后取出芒草，压榨脱水过滤，芒草含水量约为60%，预处理后的芒草中纤维素含量约60% ；
(3)同步糖化发酵:在1L机械搅拌发酵罐中(装液量7L)加入0.4%KH2P04，0.4%(NH4) 2S04，0.2%MgS04，1% 酵母粉，0.02%MnS04，2.5g/L 吐温-20，步骤(I)中的酵母种子液，步骤(2)中的芒草和自制纤维素酶，其中，酿酒酵母种子接种量10%，芒草总加入量为15% (w/V，按干重计)，即1050g，纤维素酶按照每Ig预处理后的芒草加入20FPU的比例加入，在35°C下以150rpm的转速搅拌培养96h，发酵结束，乙醇的含量测定是取发酵液离心，将得到的上清液稀释后进高效液相色谱进行检测。乙醇浓度40.5g/L，为理论转化率的78.4%。
[0013]实施例2:
Cl)耐高温酿酒酵母种子液准备:将耐高温酿酒酵母接种于YEro平板，于36°C恒温培养箱培养3d，待形成菌落后，用接种针挑取一环(约5X106个)，接于10mL耐高温酿酒酵母种子培养基中，于36°C，转速180rpm的恒温摇床中震荡培养12h，将培养好的一级种子液按10%接种量再转接入2L的二级种子培养罐中(装液量1L)，35-370C，转速180rpm，通气速率lvvm，扩培12h。耐高温酿酒酵母种子培养基组成:5%葡萄糖，0.4% KH2PO4,0.4% (NH4)2SO4,0.2% MgSO4,1% 酵母粉，0.02%MnS04，PH 值为 5.0 ；
(2)芒草预处理:将粗粉至l-2cm的芒草与自来水按1.5:10 (w/v)的比例混合后，放入水热反应釜中，加热至220°C，维持15min，降温后取出芒草，压榨脱水过滤，芒草含水量约为60%，预处理后的芒草中纤维素含量约为65% ；
(3)同步糖化发酵:在1L机械搅拌发酵罐中(装液量7L)加入0.4%KH2P04，0.4%(NH4) 2S04，0.2%MgS04，1% 酵母粉，0.02%MnS04，2.5g/L 吐温-20，步骤(I)中的酵母种子液，步骤(2)中的芒草和自制纤维素酶，其中，酿酒酵母种子接种量10%，芒草总加入量为15% (w/V，按干重计)，即1050g，纤维素酶按照每Ig预处理后的芒草加入20FPU的比例加入，在36°C下以150rpm的转速搅拌培养96h，发酵结束，乙醇的含量测定是取发酵液离心，将得到的上清液稀释后进高效液相色谱进行检测。乙醇浓度47.2g/L,为理论转化率的85.1%。
[0014]实施例3:
Cl)耐高温酿酒酵母种子液准备:将耐高温酿酒酵母接种于YEH)平板，于37°C恒温培养箱培养3d，待形成菌落后，用接种针挑取一环(约5X106个)，接于10mL耐高温酿酒酵母种子培养基中，于37°C，转速180rpm的恒温摇床中震荡培养12h，将培养好的一级种子液按10%接种量再转接入2L的二级种子培养罐中(装液量1L)，35-370C，转速180rpm，通气速率lvvm，扩培12h。耐高温酿酒酵母种子培养基组成:5%葡萄糖，0.4% KH2PO4,0.4% (NH4)2SO4,
0.2% MgSO4,1% 酵母粉，0.02%MnS04，PH 值为 5.0 ；
(2)芒草预处理:将粗粉至l-2cm的芒草与自来水按1.5:10 (w/v)的比例混合后，放入水热反应釜中，加热至225°C，维持15min，降温后取出芒草，压榨脱水过滤，芒草含水量约为60%，预处理后的芒草中纤维素含量约为69% ；
(3)同步糖化发酵:在1L机械搅拌发酵罐中(装液量7L)加入0.4%KH2P04，0.4%(NH4) 2S04，0.2%MgS04，1% 酵母粉，0.02%MnS04，2.5g/L 吐温-20，步骤(I)中的酵母种子液，步骤(2)中的芒草和自制纤维素酶，其中，酿酒酵母种子接种量10%，芒草总加入量为15% Cw/V，按干重计)，即1050g，纤维素酶按照每Ig预处理后的芒草加入20FPU的比例加入，在37°C下以150rpm的转速搅拌培养96h，发酵结束，乙醇的含量测定是取发酵液离心，将得到的上清液稀释后进高效液相色谱进行检测。乙醇浓度52.4g/L，为理论转化率的88.7%。
[0015]本发明通过优化预处理条件和同步糖化发酵温度，使纤维酶解效率和乙醇转化效率都明显提高，最终纤维素转化效率接近90%，加之使用以芒草为原料生产纤维素酶，提高了酶解效率，大大地降低了纤维素乙醇的生产成本。
【主权项】
1.一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)酵母种子液准备:将酿酒酵母接种于YEro平板，于35-37°C恒温培养箱培养2-3天，用接种针挑取一环接于酿酒酵母种子液体培养基中，于35-37°C，转速ISOrpm的恒温摇床中震荡培养12h，得到一级种子液，再转接入2L的二级种子培养罐中，35-37°C，转速180rpm，通气速率12h ； (2)芒草预处理:将粗粉至l-2cm的芒草与自来水按1.5:10的比例混合后，放入高温高压水热反应釜中，加热至220-225°C，维持10-15min，降温后取出芒草，压榨脱水过滤； (3)同步糖化发酵:在发酵罐中加入0.4%KH2P04，0.4% (NH4)2SO4,0.2%MgS04，1%酵母粉，0.02%MnS04，2.5g/L吐温-20，步骤(I)中的酵母种子液和步骤(2)中的芒草，同时按照每Ig预处理后的芒草加入20FPU的比例加入自产纤维素酶，在35-37°C下以150rpm的转速搅拌培养96h，发酵结束，测定发酵液中乙醇浓度。
2.根据权利要求1所述的一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，其特征在于，步骤(3 )中加入的纤维素酶是以芒草为底物自产的纤维素酶。
3.根据权利要求1所述的一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，其特征在于，步骤(3)中加入15%预处理后的芒草。
4.根据权利要求1所述的一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，其特征在于，步骤(3)中酿酒酵母种子接种量为10%。
5.根据权利要求1所述的一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，其特征在于，步骤(I)所用酵母为耐高温酿酒酵母。
【专利摘要】本发明公开了一种利用芒草同步糖化发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：准备酵母种子液；芒草预处理；同步糖化发酵。本发明的优点是：芒草材料的无污染水热预处理方法，不添加任何酸碱等化合物，毒性物质少，设备要求简单；同时利用以芒草为底物自产的纤维素酶，具有酶解效率高、成本低等特点。
【IPC分类】C12P7-10, C12R1-865
【公开号】CN104561128
【申请号】CN201410847568
【发明人】杨文慧, 牛堃
【申请人】江苏迪因生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日