膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白工程技术领域，具体涉及一种膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的 方法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是人体内含量最多的一种蛋白质，在皮肤、骨骼、软骨、血管等组织器官 广泛分布，尤其大量存在于皮肤和结缔组织中。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成 高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中。 目前我国生产胶原蛋白主要利用酸碱法从猪、牛等的皮、腱等为原料，此种方法虽然产量较 大，但是生产的胶原蛋白水溶性差、纯度低且存在病毒隐患，生产过程产生废水对环境污染 严重。
[0003] 随着现代生物技术的发展，利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物、植物和 微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时 也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种 高效的真核表达系统，它具有表达量高、稳定性好、成本相对较低、能分泌至胞外、便于工业 化生产等优点，因而可用于胶原蛋白的产业化发酵生产。
[0004] 中国专利申请专利号为201010602214. 8公开了一种毕赤酵母表达重组类人胶原 蛋白的生产方法，该方法公开了以下内容：
[0005] "对发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、凝胶柱层析、沉淀脱色、 离子交换层析和超滤脱盐，得到重组类人胶原蛋白。"
[0006] 上述方法中，操作提取工艺流程繁琐，工艺参数不易控制。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、蛋白产率高、收率高及纯度高， 且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的 方法。
[0008] 本发明膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastori SMD1168作为菌种，进行种子培养、种子 罐培养和发酵罐培养，得到毕赤酵母菌发酵液；
[0010] 2)毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白：
[0011] a除杂：将毕赤酵母菌发酵液通过陶瓷膜进行水洗过滤，保留滤液；
[0012] b脱色：向步骤a)所得滤液中加入0· 5-10mol/L的盐酸调节pH到3. 5?4. 5,静 置8?12h，沉淀脱色，收集上清液；
[0013] C超滤：采用截留分子量为300-350kD的超滤膜对步骤b)所得上清液进行超滤， 收集滤液；再用用截留分子量25-30kD的超滤膜超滤上述滤液，收集滤液；最后用截留分子 量5-10kD的纳滤膜将上述滤液超滤，获得高浓度胶原蛋白浓缩液；
[0014] d冻干：将上述高浓度胶原蛋白浓缩液放入冻干机进行真空冷冻干燥，获得重组 类人胶原蛋白I型固体纤维状粉末。
[0015] 所述步骤2)中脱色过程中，pH为4. 0。
[0016] 所述步骤2)中，超滤过程依次使用截留分子量为300kD、30kD、10kD的超滤膜。
[0017] 本发明中发酵过程所用毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoriSMD1168,于 2013年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏中心地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮政编码：100101)，保藏编 号为 CGMCC No. 7981。
[0018] 本发明的有益效果为：本发明膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，工艺简单、 蛋白收率高，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产的膜过滤法提取重组类 人胶原蛋白的方法。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1
[0020] L菌种：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoriSMDl 168,保藏编号为CGMCC No. 7981， 保藏日期2013年8月5日；
[0021] 2.培养基：
[0022] 1)种子培养基为BMGY培养基，组成为（体积分数）：
[0023] 酵母浸出粉5% 蛋白胨10%
[0024] pH6. 0的磷酸钾缓冲溶液5% YNB 1. 34%
[0025] Biotin 0. 33% 甘油 10% ;
[0026] 2)种子罐培养基（30L):
[0027] 磷酸二氢钾 1305g 氯化钙35.4g 七水硫酸镁 380g 硫酸钾700g 甘油 600ml 氯化锌500g;
[0028] 3)发酵罐培养基（300L):
[0029] 磷酸二氢钾13.05kg 氯化钙3.54kg 七水硫酸镁3. 80kg 硫酸钾7. OOkg
[0030] 甘油 6L 氯化锌5kg;
[0031] 发酵方法：
[0032] 1)摇瓶种子培养：
[0033] 将甘油保存的菌种接种到含有300ml种子培养基的摇瓶中，30°C，300r/min培养 24h ；
[0034] 2)种子罐培养：
[0035] 将摇瓶中的种子液全部转入含30L种子罐培养基的50L发酵罐中，30°C培养，氨水 调控ρΗ5· 0,溶氧控制在25%，罐压0· IMPa，搅拌IOOrpm,培养48h ;
[0036] 3)发酵罐培养：
[0037] 将种子罐培养液30L转入含300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，30°C培养，氨水 调控PH5.0,溶氧控制在40%，搅拌150rpm，溶氧值到达最高点100%时，说明罐内甘油消 耗已尽，开始补料流加甘油，维持溶氧在40%以下；菌体湿重约150g/L后，停止甘油补料， 待溶氧回升至40%后维持2h，开始甲醇诱导，诱导阶段罐温维持28°C，pH5. 0,甲醇补料流 速为6. 5L/h，补料过程溶氧下降，等待溶氧回升至100%，以同样流速补加甲醇，如此循环 72h，得到发酵液；
[0038] 毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白：
[0039] a除杂：将发酵液通过IOOnm孔径陶瓷膜进行水洗过滤，收集滤液500L ;
[0040] b脱色：向步骤a所得滤液中加入0. 5mol/L的盐酸调节pH到4. 0,静置沉淀脱色 8h，收集上清液500L ;
[0041] c超滤：采用截留分子量为300kD的超滤膜对步骤b所得上清液进行超滤，收集滤 液50L ;再用用截留分子量25kD的超滤膜超滤上述滤液，收集滤液20L ;每次加水后测透出 液电导，初始电导为5370 μ m/cm，电导降至85 μ m/cm，说明了小分子杂质和盐类已基本除 去；最后用截留分子量5kD的纳滤膜将上述滤液超滤，获得高浓度胶原蛋白浓缩液2L ;
[0042] d冻干：将上述高浓度胶原蛋白浓缩液放入冻干机进行真空冷冻干燥，获得重组 类人胶原蛋白I型固体纤维状粉末，胶原蛋白收率为72. 65%，纯度83. 60%。
[0043] 实施例2
[0044] L菌种：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoriSMDl 168,保藏编号为CGMCC No. 7981， 保藏日期2013年8月5日；
[0045] 2.培养基：
[0046] 1)种子培养基为BMGY培养基，组成为（体积分数）：
[0047] 酵母浸出粉5% 蛋白胨10%
[0048] ρΗ6·0磷酸钾缓冲溶液5% YNB 1.34%
[0049] Biotin 0. 33% 甘油 10% ;
[0050] 2)种子罐培养基（30L):
[0051] 磷酸二氢钾 1305g 氯化钙35.4g 七水硫酸镁 380g 硫酸钾700g 甘油 600ml 氯化锌500g;
[0052] 3)发酵罐培养基（300L):
[0053] 磷酸二氢钾13.05kg 氯化钙3.54kg 七水硫酸镁3. 80kg 硫酸钾7. OOkg 甘油 6L 氯化锌5kg;
[0054] 发酵方法：
[0055] 1)摇瓶种子培养：
[0056] 将甘油保存的菌种接种到含有300ml种子培养基的摇瓶中，30°C，300r/min培养 24h ；
[0057] 2)种子罐培养：
[0058] 将摇瓶中的种子液全部转入含30L种子罐培养基的50L发酵罐中，30°C培养，氨水 调控ρΗ5· 0,溶氧控制在40%，罐压0· IMPa，搅拌200rpm，培养48h ;
[0059] 3)发酵罐培养：
[0060] 将种子罐培养液30L转入含300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，30°C培养，氨水 调控pH5. 0,溶氧控制在30%，搅拌300rpm，溶氧值到达最高点100%时，说明罐内甘油消 耗已尽，开始补料流加甘油，维持溶氧在40%以下；菌体湿重约150g/L后，停止甘油补料， 待溶氧回升至40%后维持2h，开始甲醇诱导，诱导阶段罐温维持28°C，pH5. 0,甲醇补料流 速为6. 5L/h，补料过程溶氧下降，等待溶氧回升至100%，以同样流速补加甲醇，如此循环 72h ；
[0061] 毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白：
[0062] a除杂：将350L发酵液通过IOOnm陶瓷膜进行水洗过滤，收集滤液500L ;
[0063] b脱色：向步骤a所得滤液中加入I. Omol/L的盐酸调节pH到4. 0,静置沉淀脱色 8?12h，收集上清液500L ;
[0064] c超滤：采用截留分子量为350kD的超滤膜对步骤b所得上清液进行超滤，收集滤 液50L ;再用用截留分子量30kD的超滤膜超滤上述滤液，收集滤液20L ;每次加水后测透出 液电导，初始电导为6785 μ m/cm，电导降至80 μ m/cm，说明了小分子杂质和盐类已基本除 去；最后用截留分子量IOkD的纳滤膜将上述滤液超滤，获得高浓度胶原蛋白浓缩液2L ;
[0065] d冻干：将上述高浓度胶原蛋白浓缩液放入冻干机进行真空冷冻干燥，获得重组 类人胶原蛋白I型固体纤维状粉末，收率为69. 87%，纯度80. 40 %。
【主权项】
1. 一种膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastori SMDl 168作为菌种，进行种子培养、种子罐培 养和发酵罐培养，得到毕赤酵母菌发酵液； 2) 毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白： a除杂：将毕赤酵母菌发酵液通过陶瓷膜进行水洗过滤，保留滤液； b脱色：向步骤a)所得滤液中加入0. 5-10m〇l/L的盐酸调节pH到3. 5?4. 5,静置8? 12h，沉淀脱色，收集上清液； c超滤：采用截留分子量为300-350kD的超滤膜对步骤b)所得上清液进行超滤，收集 滤液；再用用截留分子量25-30kD的超滤膜超滤上述滤液，收集滤液；最后用截留分子量 5-10kD的纳滤膜将上述滤液超滤，获得高浓度胶原蛋白浓缩液； d冻干：将上述高浓度胶原蛋白浓缩液放入冻干机进行真空冷冻干燥，获得重组类人 胶原蛋白I型固体纤维状粉末。
2. 根据权利要求1所述的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 步骤2)中脱色过程中，pH为4.0。
3. 根据权利要求1所述的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 步骤2)中，超滤过程依次使用截留分子量为300kD、30kD、10kD的超滤膜。
【专利摘要】本发明公开了一种膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法,属于蛋白工程技术领域，采用巴斯德毕赤酵母Pichia？pastori？SMD1168作为菌种，进行种子培养、种子罐培养和发酵罐培养，得到毕赤酵母菌发酵液；在通过除杂、脱色、超滤和冻干的操作，从毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白。本发明膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法，工艺简单、蛋白收率高，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产的膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法。
【IPC分类】C12P21-02, C07K1-36, C12R1-84
【公开号】CN104561201
【申请号】CN201410837503
【发明人】刘珂, 朱维忠, 王静, 刘官军, 张兴灿, 宋超
【申请人】山东鲁抗医药股份有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日