一种用于检测鸽圆环病毒的引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测鸽圆环病毒的引物和探针，属于动物分子病毒学领域。
【背景技术】
[0002]圆环病毒科(Circoviridae)包括2个属:圆圈病毒属(Gyrovirus)和圆环病毒属(OcoFirw1S)。圆圈病毒属只有鸡贫血病毒(chicken infect1us anemia virus, CIAV)一个成员；而圆环病毒属目前有包括猪圆环病毒I型和II型(two porcine circoviruses,PCVl、PCV2)、婴I踏_羽病毒(psittacine beak and feather disease virus, BFDV)、鴻圆环病毒(pigeon circovirus, PiCV)、我鸟圆环病毒(goose circovirus, GoCV)、鸭圆环病毒(duck circovirus, DuCV)、金丝雀(canary circovirus, CaCV)、渡牙鸟(raven circovirus,RaCV)、 A 哥(starling circovirus, StCV)> 雀(finch circovirus, FiCV)、区鸟(gullcircovirus, GuCV)和天鹅(mute swans (Cygnus olor) circovirus, SwCV)等动物发现圆环病毒。
[0003]鸽圆环病毒(PiCV)最早于1993年在美国报道，此后在加拿大、澳大利亚、德国、英国、法国、比利时、意大利和美国均发现有感染报道。余旭平等最早在我国浙江检测到鸽圆环病毒感染，并对浙江省鸽圆环病毒的基因组结构进行分析。
[0004]到目前为止，圆环病毒属除PCV (PCV1和PCV2)可以在PK-15细胞中繁殖外，其余成员均尚未能在细胞中培养成功，大大限制了对其进行深入研究，因而病原诊断方法相对较少。目前，已有基于SYBR I实时荧光定量PCR方法相关研究报道。【Duchatel JP, Todd
D,Willeman C， Losson B.Quantificat1n of pigeon circovirus in serum, blood,semen and different tissues of naturally infected pigeons using a real-timepolymerase chain react1n.Avian Pathol.2009 Apr; 38 (2): 143-8.】但是未见基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法用于检测鸽圆环病毒的研究报道，但该属其他类型病毒如猪圆环病毒和鹅圆环病毒均已经有相应的荧光定量PCR检测方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于检测鸽圆环病毒的引物和探针。目前已有基于SYBR I实时荧光定量PCR方法相关研究报道，但是未见基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法用于检测鸽圆环病毒的研究报道。
[0006]为达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
用于检测鸽圆环病毒的引物和探针包括:
一种用于检测鸽圆环病毒的引物，所述引物序列如下:
上游引物:5’ - CACATTCATAATACATGGGGTCAGG -3’，
下游引物:5’ - CAAAGCCCCAACTAACAATCTCAG -3’。
[0007]一种用于检测鸽圆环病毒的探针，所述探针序列为:5’ - (FAM) CACGGCAAACCAAACGGCAGCAACC -3，(Eclipse)。
[0008]利用本发明的引物和探针可用于对鸽圆环病毒的相应基因进行检测，尤其适用于基于TaqMan荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于检测纟鸟圆环病毒的TaqMan突光定量PCR方法。
[0009]具体操作方法如下:
1、引物和探针设计:
参考鴻圆环病毒基因组核苷酸序列，利用Lasergene v 7.1 DNAStar软件进行同源性分析比较，利用Oligo 7.0软件，设计引物和探针，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为Eclipse，采用BLAST工具进行检索，验证其特异性。
[0010]2、反应体系的优化:
优化出的20 μ L最佳反应体系为:Premix Ex Taq?(Probe qPCR) 10 μ L、上、下游引物(10 μ Μ)各0.6 μ L、荧光探针(5 μΜ)0.3yL、模板2 μ L、灭菌去粒子水补足至终体积20 μ L0最佳反应条件为:95 V Imin预变性；95 V 15 s、55 °C 15 s、72 V 20 s，共40个循环。
[0011 ] 3、阳性标准品的制备:
按试剂盒说明的方法提取的鸽圆环病毒DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到PMD18-T载体上，转化，提取质粒，得到阳性标准品(PiCV -T)。
[0012]4、标准曲线的建立:
以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
[0013]该方法可用于鸽圆环病毒的流行病学检测，为疾病的早期预防控制奠定技术基础。同时，该方法的建立为研究该病原的复制动力学提供检测平台。
[0014]本发明的有益效果:
本发明根据鸽圆环病毒基因组序列，设计引物和探针，于国内外首先建立鸽圆环病毒的荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测63.7 copies，特异性强，重复性好。
【附图说明】
[0015]图1鸽圆环病毒的荧光定量PCR方法的扩增曲线。
[0016]图2为鸽圆环病毒的荧光定量PCR方法的标准曲线。
【具体实施方式】
[0017]实施例1鸽圆环病毒的荧光定量PCR方法的建立
一、材料:
鸽圆环病毒(GenBank登录号:JN183455)
二、步骤 1、试剂:
Premix Ex Taq? (Ex Taq plus dye)>Premix Ex Taq? (Probe qPCR)、pMD18_T 载体、DL2000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；HP Tissue DNA Midi KU、胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Omega B1-Tek ;荧光定量PCR管购自Axygen。
[0018]2.引物和探针的特异性
引物和探针的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据NCBI中鸽圆环病毒基因组序列，通过比对分析，设计引物和探针。
[0019]3、阳性标准品的制备
按照HP Tissue DNA Midi Kit说明书方法提取鸽圆环病毒基因组DNA。用所设计的特异性引物(上游:5’_ ATGACACTAGTAAAGGGACCCAA -3’ ；下游:5’_ TCCCATTTGAGGACTATCA-3’，扩增片段大小约734 bo扩增体系为50 μ L,其中Premix Ex Taq?(Ex Taq plus dye)25 μ L、上下游引物(20 μ Μ)各I μ L、基因组DNA模板I μ L，补充灭菌去离子水至终体积50μ L0反应条件为94°C预变性5min，随后进行94°C 50s、54°C 35s、72°C 50s循环35次后，72°C延伸lOmin。反应结束后，取PCR产物5 μ L，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳。将PCR产物经胶回收试剂盒纯化后与PMD18-T载体连接，转化DH5 α感受态细胞，用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒。阳性重组质粒进行序列测定。测序结果表明，阳性重组质粒符合预期，即做为阳性标准品(PiCV -Τ)，计算拷贝数。
[0020]4.反应条件的优化
采用 20 μ L 反应体系[Premix Ex Taq? (Probe qPCR) 10 μ L，PCR 上 / 下游引物(10 μ M)各0.6 μ L，荧光探针(5 μ Μ) 0.3 μ L，倍比稀释后的阳性质粒标准品2 μ L，补水至终体积20μ L]，以出现最高的荧光值(Λ Rn)、最小的Ct值为指标，对退火温度(52?64°C)、引物终浓度(0.1?I μΜ)及探针终浓度(0.05?0.5 μ Μ)进行优化。
[0021]5、建立的标准曲线
用紫外分光光度计测定阳性标准品260 nm处光吸收值(Α260)，计算DNA拷贝数，随后将阳性标准品进行连续10倍系列稀释(KT1?10 _7)，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。反应条件为:95 V Imin预变性；95 V 15 s、55V 15 s、72 V 20 s，共 40 个循环。
[0022]对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，荧光定量PCR方法对鸽圆环病毒的最低检测限为453拷贝数/反应，并且CT与拷贝数在63.7X 11?63.7X 10 5拷贝/反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.998，扩增效率为99.9%。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。
[0023]6特异性检测
6.1特异性检测
用优化的条件分别检测鸽副粘病毒、鸽肝炎病毒I型、鸽源禽流感病毒核酸(均提取核酸后反转录成cDNA)，进行检测，对其特异性进行评价。结果检测均为阴性，荧光定量PCR产物电泳均未见条带。
[0024]6.2可重复性及再现性评估
对同一阳性标准品设5个重复管，用建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数。将阳性标准品置于一 20°C冰箱保存，分别于第I周、第2周、第3周、第4周、第5周重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.36%?1.42%，组间变异系数为0.71%?2.63%，均小于5%，符合实验预期，可重复性好。
[0025]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种用于检测鸽圆环病毒的引物，其特征在于，所述引物序列如下: 上游引物:5’ - CACATTCATAATACATGGGGTCAGG -3’， 下游引物:5’ - CAAAGCCCCAACTAACAATCTCAG -3’。
2.—种用于检测鸽圆环病毒的探针，其特征在于，所述探针序列为:5’-CACGGCAAACCAAACGGCAGCAACC -3’，其5’ -端标记荧光报告基团FAM，3’ -端标记荧光淬灭基团 Eclipse.
3.—种如权利要求1或3所述的引物及探针在检测鸽圆环病毒产品上的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测鸽圆环病毒的引物和探针，所述引物序列为：上游引物：5’-？CACATTCATAATACATGGGGTCAGG？-3’，下游引物：5’-？CAAAGCCCCAACTAACAATCTCAG-3’，所述探针序列为：5’-（FAM）CACGGCAAACCAAACGGCAGCAACC-3’？(Eclipse)。本发明根据NCBI(National？Center？for？Biotechnology？Information）数据库中鸽圆环病毒基因组序列，设计特异性的引物和探针，于国内外首先建立鸽圆环病毒基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，最低可检测63.7个拷贝。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-70, C12Q1-68, C12R1-93
【公开号】CN104561381
【申请号】CN201510010971
【发明人】万春和, 黄瑜, 陈红梅, 傅秋玲, 程龙飞, 施少华, 傅光华, 陈翠腾
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月10日