抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体 (anti- deoxynivalneol Monoclonal antibody, anti-DON McAb)的纳米抗体（Variable domain of heavy chain of heavychain antibody, VHH)制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 脱氧雪腐镰刀菌稀醇（deoxynivalneol，DON)是一种单端孢霉稀族毒素，主要由 镰刀菌产生，广泛存在于大麦、小麦、玉米、燕麦和大米等农作物及其制品中。DON具有细胞 毒性、胚胎毒性和免疫毒性等，可引起厌食、呕吐、腹泻、发烧和生长缓慢等症状，严重威胁 人类及动物的健康。由于DON的高污染率和高毒性，对食品中DON的检测具有重要意义。 [0003]目前，检测食品中DON的方法主要有薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、表面等 离子共振及免疫学检测等方法，免疫学检测方法由于其检测方便、成本低廉、灵敏度高等优 势在DON的检测应用广泛。然而，在建立免疫学检测方法的过程中，必不可免的需要以DON 标准品为原料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，DON标准品不仅价格昂贵而且具有较强 的毒性，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，从而在一定程度上制约了免疫学检测 方法的应用和推广。因此，人们开始利用抗独特型抗体和抗原模拟表位来实现有害小分子 物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示技术的主要特点是可有效地筛选出 与目标靶分子特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位 点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等 方面应用广泛。
[0004] 本发明通过用噬菌体展示技术，从驼源天然单域重链抗体库中筛选能与靶分子 (抗DON单克隆抗体)特异性结合的纳米抗体（VHH)，以纳米抗体作为DON抗原的替代物应用 于免疫学分析检测领域。该方法避免了传统抗独特型抗体制备所需的动物免疫过程，且具 有普遍适用性，筛选得到的纳米抗体具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，可替代价 格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体。
[0006] 本发明以抗DON单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入驼源 天然单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种可特异性结合抗DON单克隆抗体的纳米抗 体（A31)，其具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。
[0007] 其氨基酸序列的頂GT编号和结构域划分如图1所示。
[0008] 本发明所提及的纳米抗体包括四个框架区（Framework region, FR)和三个互补 决定区（Complementarity-determining region, CDR)。其中，框架区（FR1-FR4)分别选自 SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :6和 SEQ ID NO. :8,互补决定区（CDR1-CDR3) 分别选自SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7。框架区结构相对保守，主要 起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。
[0009] 本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :6和SEQ ID NO. :8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序 列有90%同源性。
[0010] 本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80%同源 性。
[0011] 本发明还涉及编码该纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO. :9。
[0012] 本发明提及的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量 制备。噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产 展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基 因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
[0013] 本发明还涉及所述纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括 酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫 学分析检测类型。
[0014] 本发明所述的纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的 噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后 以蛋白的形式进行免疫学检测分析。
[0015] 本发明还涉及该纳米抗体在免疫学检测分析中的应用，具体为纳米抗体在制备 DON的模拟物试剂中的应用。
[0016] 本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能 够获得性质（亲和力、特异性和稳定性等）更好的突变体。
[0017] 本发明中所叙述的一些术语具有如下含义： 同源性：描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸 序列之间的同源性百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处 的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以 【100%】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加（与第一 氨基酸相比)被认为是有差别。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计算 机运算程序(如：NCBI Blast)获得。
[0018] 结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
[0019] IMGT 编号：IMGT 数据库（The International ImMunoGeneTics Database)中的 一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献（Ehrenmann， F. , Q. Kaas, et al. (2010). "IMGT/3Dstructure_DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF." Nucleic Acids Res 38 (Database issue): D301-307. Lefranc，M. P. , C. Pommie, et al. (2003). 〃IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. 〃 Dev Comp Immunol 27(1): 55-77.)中的描述。
[0020] 密码子（codon):亦称三联体密码（triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷酸 三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
[0021] 前述纳米抗体可以替换价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相 包被抗原应用于DON的免疫学检测，该纳米抗体具有与天然DON分子相似的免疫反应特性， 效果良好。
[0022] 本发明的有益效果是：本发明纳米抗体可以替代价格昂贵且毒性强的DON标准 品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测。该纳米抗体具有与天然DON 分子相似的免疫反应特性，可提高DON检测灵敏度，减少DON标准品对操作人员健康和环境 的危害，节约成本。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质抗 原替代物的筛选和制备，具有很高的应用价值。
【附图说明】
[0023] 图1为纳米抗体（A31)的氨基酸编号及结构域示意图。
[0024] 图2为以纳米抗体（A31)建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围为 5. 02-80. 37 ng/mL，IC5。为 19. 97 ng/mL。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1.驼源天然单域重链抗体库的构建 1)驼源白细胞的分离：在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入等体积血液样品， 1000 g离心50 min ;小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入1/2体积的 PBS，1000g离心1 5min ;弃上清，用PBS洗下离心管壁上的白细胞，1000g离心10min ;弃上 清，加入500 yL PBS重悬白细胞并计数；以体积比1 :15加入裂解液（RNAiso)保存备用。
[0026] 2)总RNA提取：向上述裂解液中加入1/4体积的氯仿，剧烈震荡20 s使其充分 乳化，室温静置5 min;4°C 12000g离心15 min，取上清转移至另一新鲜离心管中；加入 等体积的异丙醇，充分混勾后室温静置l〇min;4°C 10000g离心20 min，弃上清，缓慢加入 75%乙醇lmL，小心洗涤离心管管壁；4°C，12000g离心5 min后弃去乙醇；室温干燥沉淀 5 min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 °C保存。
[0027] 3)cDNA的合成：将反转录用的引物、dNTP Mixture和模板RNA混合，65 °C 5min， 迅速冰浴。具体配制如下：
【主权项】
1. 可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌稀醇抗体的纳米抗体，其特征在于具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述纳米抗体的氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO. :9。
3. 如权利要求1所述纳米抗体的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增或基因工程重 组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生 物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的 方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米 抗体的大量制备。
4. 权利要求1所述纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。
5. 如权利要求4所述应用，其特征在于该纳米抗体以固相抗原或竞争抗原在免疫学检 测分析中的应用。
6. 如权利要求4所述应用，其特征在于该纳米抗体在制备DON模拟物试剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体制备及其应用,其氨基酸序列SEQ ID NO.:1，还涉及编码该氨基酸的核苷酸。本发明纳米抗体可以替代价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测，该纳米抗体具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，效果良好。纳米抗体相比于传统的基于多肽的抗原模拟表位及基于IgG的传统抗独特型抗体，具有结构更加稳定、耐酸碱和高温、检测灵敏度高等特性，因此其免疫检测稳定性得到了极大的提升，同时对环境的耐受能力也得到了提升。
【IPC分类】G01N33-577, C07K16-42, C12N15-13, G01N33-543
【公开号】CN104592389
【申请号】CN201410788812
【发明人】许杨, 何庆华, 邱雨楼
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月19日