一种铁皮石斛内生真菌菌株nt04y01及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种铁皮石斛内生真菌菌株及其应用，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各 种组织和器官内部的真菌，与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和 地上部分的任何组织器官都能存在（Faeth&Fagan，2002)。研宄发现：植物内生真菌不仅包 括了互惠共利的和中性的内共生真菌，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原菌；有的内生 真菌能促进宿主植物的生长、增强宿主的抗逆性、促进宿主植物活性成分的合成和积累，在 提高植物产量和质量中可以起到积极作用。因此，内生真菌与植物的互作研宄己日益受到 研宄者的关注，并成为内生真菌研宄领域的国际热点。
[0003] 铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)属兰科附生草本植物，是我 国传统名贵中药，广泛运用于慢性咽炎、闭塞性周围血管病、白内障、青光眼等疾病的治疗 药方及各种保健品中，市场需求量很大，长期无节制的采挖造成其资源枯竭，已无野生资源 可用。近年来，铁皮石斛的人工种植已在浙江、云南等地大规模开展，成为一个新兴产业。因 此，研宄筛选具有明显促生作用的铁皮石斛内生真菌菌株，将对铁皮石斛的大规模人工种 植具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种具有明显促生作用的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01 及其在铁皮石斛生长中的应用。
[0005] 本发明所提供的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01，在分类学上属于丛赤壳属 (他(^1^&)，命名为他(^1^ &8口.，已于2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏号为CCTCCNO.M2014331 ;该菌株的基因组18srDNA碱基序列如SEQIDNo. 1所示。
[0006] 本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01是采用内生真菌分离纯化技术从 铁皮石斛?endrobiumofficinaleKimuraetMigo)植物活体中分离、纯化得到。
[0007] 本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01可通过制备成真菌诱导子培养基 或生物菌肥应用于铁皮石斛的生长中。
[0008]由本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01制备真菌诱导子培养基的方法， 包括如下步骤：菌种活化一种子液培养一发酵培养一将发酵液真空抽滤，将菌丝体与液氮 研磨液与滤液合并后灭菌，得到真菌诱导子一将真菌诱导子接入MS培养基中，即得真菌诱 导子培养基。
[0009] 作为优选方案，真菌诱导子按5%?15%体积的量接入MS培养基中。
[0010] 由本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01制备生物菌肥的方法，包括如下 步骤：菌种活化一种子液培养一发酵培养一将发酵液与树皮粉搅拌混匀，即得生物菌肥。
[0011] 作为优选方案，按每50g树皮粉加5?15mL发酵液搅拌混勾。
[0012] 作为优选方案，上述的菌种活化采用试管斜面培养，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂 培养基（固体PDA)，于28 ± 1°C活化培养72小时。
[0013] 作为优选方案，上述的种子液培养采用马铃薯葡萄糖液体培养基（液体PDA)，于 28±1°C摇床培养72小时。
[0014] 作为优选方案，上述的发酵培养采用马铃薯葡萄糖液体培养基（液体PDA)，于 28±1°C发酵培养7天，接种量为5V%?15V%。
[0015] 实验证明：采用本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01制备的真菌诱导子 培养基和生物菌肥均对铁皮石斛的生长具有明显的促进作用，可用于铁皮石斛的人工种植 中，以提高铁皮石斛的产量，具有显著的应用价值。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01在100倍显微镜下观察到的 菌丝（A)和孢子（B)的形态图。
[0017] 图2为本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01在电子显微镜下观察到的菌 丝形态图。
[0018] 图3为本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01在电子显微镜下观察到的孢 子形态图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
[0020] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所 述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例1
[0022] 本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01于2014年7月9日保藏于中国典 型培养物保藏中心（湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC N0.M2014331 ;该菌株的基因组18srDNA碱基序列如SEQIDNo. 1所示。
[0023] 所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01的固体培养特征为：
[0024] 在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA)培养基上于28±1°C培养，最初气生菌丝无色，渐变灰 白色；菌落呈灰白色绒毛状，边缘不整齐，近培养基处10天后有淡紫色，菌丝体较发达。
[0025] 所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01的液体培养特征为：
[0026] a)培养基PDA，摇瓶培养7天，培养温度28 ± 1°C;
[0027] b)发酵培养特征：培养第1-2天，未见明显生长现象；培养第3天，有白色菌丝出 现；培养第4-5天，菌丝增多；培养第6天，形成直径l-2mm白色菌丝球；培养第7天，菌丝 球增大到2_4mm。
[0028] 本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01的形态特征为：
[0029] 1、无性世代，菌丝体密集，近树枝状，较发达，有隔；可侧生短梗或无梗孢子（囊）， 孢子囊中最多可含8个孢子。
[0030] 2、有性世代，未发现。
[0031] 实施例2
[0032] 1)取本发明的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01菌种，在无菌条件下，用接种针挑 取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28±1°C活化培养72小时；
[0033] 2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA种子培养基中， 于28± 1°C、140rpm摇床培养72小时，得种子液；
[0034] 3)在无菌条件下，按10V% (体积百分比）接种量接入500mL液体PDA培养基中， 于28 ± 1 °C、140rpm摇床培养7天；
[0035] 4)将发酵液真空抽滤，菌丝体与液氮的研磨液与滤液合并，于121°C灭菌20分钟， 得到真菌诱导子；
[0036] 5)将真菌诱导子按10%体积的量接入MS培养基中，得到真菌诱导子培养基；
[0037] 6)在无菌条件下，接苗于对照（MS)培养基和真菌诱导子培养基中，无菌室培养， 记录好苗的数量，根数目及高度；
[0038] 7)定期观察，培养6个月后，对原球茎、苗进行称重，并计算增苗棵数，与对照组进 行组间分析；观察结果见表1所示；
[0039] 表1真菌诱导子对铁皮石斛苗增殖分化的影响（X土S)
[0040]
【主权项】
1. 一种铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01，其特征在于：该菌株在分类学上属于丛赤壳 属，命名为Nectria sp.，已于2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC N0.M2014331 ;该菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 权利要求1所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01在铁皮石斛生长中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：将铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01制备成 真菌诱导子培养基或生物菌肥应用于铁皮石斛的生长中。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，由所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01制 备真菌诱导子培养基的方法包括如下步骤：菌种活化一种子液培养一发酵培养一将发酵液 真空抽滤，将菌丝体与液氮研磨液与滤液合并后灭菌，得到真菌诱导子一将真菌诱导子接 入MS培养基中，即得真菌诱导子培养基。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：真菌诱导子按5%?15%体积的量接入MS 培养基中。
6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，由所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01制 备生物菌肥的方法包括如下步骤：菌种活化一种子液培养一发酵培养一将发酵液与树皮粉 搅拌混匀，即得生物菌肥。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于：按每50g树皮粉加5?15mL发酵液搅拌混 匀。
8. 如权利要求4或6所述的应用，其特征在于：所述的菌种活化采用试管斜面培养，培 养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，于28±1°C活化培养72小时。
9. 如权利要求4或6所述的应用，其特征在于：所述的种子液培养采用马铃薯葡萄糖 液体培养基，于28 ± 1 °C摇床培养72小时。
10. 如权利要求4或6所述的应用，其特征在于：所述的发酵培养采用马铃薯葡萄糖液 体培养基，于28± 1°C发酵培养7天，接种量为5V%?15V%。
【专利摘要】本发明公开了一种铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01及其应用，所述菌株NT04Y01在分类学上属于丛赤壳属，命名为Nectria sp.已于2014年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014331；该菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No.1所示。实验证明：采用本发明所述的铁皮石斛内生真菌菌株NT04Y01制备的真菌诱导子培养基和生物菌肥均对铁皮石斛的生长具有明显的促进作用，可用于铁皮石斛的人工种植中，以提高铁皮石斛的产量，具有显著的应用价值。CCTCC NO. M201433120140709
【IPC分类】C12R1-645, C05F11-08, C12N1-14
【公开号】CN104593274
【申请号】CN201510044012
【发明人】黎万奎, 王莉莉, 马昭, 唐承晨, 张纯, 胡之璧, 王峥涛
【申请人】上海中医药大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月28日