昆虫细胞无血清培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无血清培养基，特别是一种适于生物反应器大规模培养制备重组 蛋白的昆虫细胞无血清培养基。
【背景技术】
[0002] 为满足基础研究和应用生物医学领域如细胞生物学、生理学、药理学和毒理学日 益广泛的应用需求，细胞培养技术应运而生。概括的讲，细胞培养技术系模拟细胞生长的体 内环境，包括温度、pH值、渗透压和氧气供应，以使细胞能很好地生长和繁殖。其中最关键 的因素是培养基。
[0003] 传统细胞培养基主要是通过在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物而 形成，其中因动物血清提取的局限，使其应用于培养基的价格格外昂贵，而且也给细胞培养 的标准化带来困难，同时也存在细胞培养表达产品分离纯化难的问题，具有潜在的细胞毒 性作用，给规模化培养细胞增加了难度。
[0004] 由于传统血清细胞培养基存在的诸多问题，促使研究人员又发展出了无血清培养 基。与传统的培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他生物提取液，具有组成成分相 对清楚，制备过程简单等优点，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖，并可避免血 清对细胞的毒性作用和血清源性污染等不利影响，有利于体外培养细胞的分化，可提高产 品的表达水平并使细胞产品易于纯化。当然，现有的无血清培养基也还存在一些缺陷，例如 保存和应用不如传统的合成培养基方便，成本较高，针对性很强，一种无血清培养基仅适合 某一类细胞的培养等。
[0005] 另一方面，在基因工程领域，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视， 常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。其中 昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前倍受青睐， 并已被广泛应用于生产外源蛋白质。
[0006]迄今为止，如L.Ikonomou.，etal(ApplMicrobiolBiotechnol, 2003, 62:1-20)，M ichaelS.，etal(Biotechnol.Prog.，1988, 14, 573-579)、R?H?齐尔瑞洛（CN1498267A)等 已经开发出多种用于培养昆虫细胞的无血清培养基，但这些培养基普遍存在成本过高，昆 虫细胞培养效率低，蛋白表达效率有待提升等问题，不利于大规模的昆虫细胞培养和重组 蛋白的制备。
【发明内容】
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种适于生物反应器大规模培养制备重组蛋白的昆 虫细胞无血清培养基，以克服现有技术中的不足。
[0008] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0009] -种昆虫细胞无血清培养基，包含氨基酸、无机盐、维生素和碳水化合物，其特征 在于它还包含0. 6?25mg/L磷脂酰胆碱，所述磷脂酰胆碱包括二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬 脂酰磷脂酰胆碱。
[0010] 作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含11200?29170mg/L氨 基酸、5500. 71 ?9510. 33mg/L无机盐、11. 354 ?820. 4mg/L维生素、3000 ?11000mg/L蛋 白水解物和6042?14222mg/L碳水化合物。
[0011] 作为尤为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含〇. 5?15mg/L二亚油酰 磷脂酰胆碱Oilineoyl-phosphatidylcholin)以及0? 1?10mg/L二硬脂酰磷脂酰胆碱 (Distearoyl-phosphatidylcholin)中的至少一者，优选同时采用该两者。
[0012] 作为更为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基还包含0. 001?0.lmg/L二 水氯化钡、0. 005?0. 02mg/L氯化锂、0. 05?7mg/L氯化镍。
[0013] 作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含丙氨酸300? 800mg/L、L-盐酸精氨酸800?2400mg/L、L-天冬酰胺900?1700mg/L、L-天冬氨酸钠盐 1000?1600mg/L、L-胱氨酸盐酸盐150?300mg/L、L-谷氨酸盐酸盐1400?2700mg/L、 L_谷氨酰胺1000?5000mg/L、甘氨酸300?800mg/L、L-组氨酸400?900mg/L、L-羟脯 氨酸500?1500mg/L、L-异亮氨酸500?1200mg/L、L-亮氨酸200?600mg/L、L-盐酸赖 氨酸500?1500mg/L、L-蛋氨酸700?1600mg/L、L-苯丙氨酸800?1700mg/L、L-脯氨 酸 400 ?950mg/L、L_ 丝氛酸 300 ?1000mg/L、L-苏氛酸 300 ?820mg/L、L_ 色氛酸 100 ? 300mg/L、L-酪氨酸二钠盐 300 ?850mg/L、L-缬氨酸 350 ?950mg/L。
[0014] 作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含四水钥酸铵0.03? 0? 2mg/L、六水氯化钴0? 03?0? 35mg/L、二水氯化铜0? 1?1. 5mg/L、七水硫酸亚铁0? 5? 4. 6mg/L、无水硫酸镁500?1500mg/L、四水氯化锰0? 01?0? 18mg/L、氯化钾1000? 1500mg/L、氯化钠3000?5000mg/L、一水磷酸二氢钠1000?1500mg/L、氯化锌0? 04? 3. 5mg/L〇
[0015] 作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含生物素0. 1?0. 5mg/L、 D-泛酸钙 0? 004 ?0? 2mg/L、氯化胆碱 10 ?400mg/L、VB12 氰钴胺 0? 2 ?1. 6mg/L、VB9 叶 酸0? 05?0? 5mg/L、i-肌醇0? 2?400mg/L、VB3烟酸0? 1?1. 9mg/L、对氨基苯甲酸0? 3? 2. 7mg/L、VB6盐酸吡哆醇0? 3?4mg/L、VB2核黄素0? 05?5mg/L、VB1盐酸硫胺0? 05? 4mg/L〇
[0016] 作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含无水葡萄糖2500? 5000mg/L、反丁烯二酸 2 ?8mg/L、2_ 酮戊二酸 10 ?40mg/L、L-苹果酸 10 ?100mg/L、一 水麦芽糖（超纯）500?3000mg/L、丁二酸4?14mg/L、Twen8010?1000mg/L、胆固醇硫酸 酯钠盐 5 ?50mg/L、VE钠 1 ?10mg/L、D-鹿糖 3000 ?5000mg/L。
[0017] 作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基还包含蛋白水解物，例如可 优选包含大麦水解物1000?5000mg/L、大米水解物2000?6000mg/L。
[0018] 在本发明的一更为具体的实施方案之中，所述昆虫细胞培养基可包含如下表1所 示组分。
[0019] 表1本发明中一典型昆虫细胞无血清培养基的配方
[0020]
【主权项】
1. 一种昆虫细胞无血清培养基，包含氨基酸、无机盐、维生素和碳水化合物，其特征在 于它还包含0. 6?25mg/L磷脂酰胆碱，所述磷脂酰胆碱包括二亚油酰磷脂酰胆碱和/或二 硬脂酰磷脂酰胆碱。
2. 根据权利要求1所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含11200? 29170mg/L 氨基酸、5500. 71 ?9510. 33mg/L 无机盐、11. 354 ?820. 4mg/L 维生素、3000 ? 11000mg/L蛋白水解物和6042?14222mg/L碳水化合物。
3. 根据权利要求1所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含0. 5?15mg/L二 亚油酰磷脂酰胆碱和/或〇. 1?l〇mg/L二硬脂酰磷脂酰胆碱。
4. 根据权利要求1所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它还包含0. 001? 0? lmg/L二水氯化钡、0? 005?0? 02mg/L氯化锂、0? 05?7mg/L氯化镍。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含 丙氨酸300?800 mg/L、L-盐酸精氨酸800?2400 mg/L、L-天冬酰胺900?1700 mg/ L、L-天冬氨酸钠盐1000?1600 mg/L、L-胱氨酸盐酸盐150?300 mg/L、L-谷氨酸盐酸 盐 1400 ?2700 mg/L、L-谷氨酰胺 1000 ?5000 mg/L、甘氨酸 300 ?800 mg/L、L_ 组氨 酸400?900 mg/L、L_轻脯氨酸500?1500 mg/L、L_异亮氨酸500?1200 mg/L、L_亮氨 酸200?600 mg/L、L-盐酸赖氨酸500?1500 mg/L、L-蛋氨酸700?1600 mg/L、L-苯丙 氨酸 800 ?1700 mg/L、L-脯氨酸 400 ?950 mg/L、L-丝氨酸 300 ?1000 mg/L、L-苏氨 酸 300 ?820 mg/L、L-色氨酸 100 ?300 mg/L、L-酪氨酸二钠盐 300 ?850 mg/L、L-缬 氛酸 350 ?950 mg/L。
6. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含四水 钥酸铵〇? 03?0? 2 mg/L、六水氯化钴0? 03?0? 35 mg/L、二水氯化铜0? 1?1. 5 mg/L、 七水硫酸亚铁0. 5?4. 6 mg/L、无水硫酸镁500?1500 mg/L、四水氯化锰0. 01?0. 18 mg/L、氯化钾1000?1500 mg/L、氯化钠3000?5000 mg/L、一水磷酸二氢钠1000?1500 mg/L、氯化锋 0? 04 ?3. 5 mg/L。
7. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含生物 素0? 1?0? 5 mg/L、D-泛酸钙0? 004?0? 2 mg/L、氯化胆碱10?400 mg/L、VB12氰钴胺 0? 2 ?1. 6 mg/L、VB9 叶酸 0? 05 ?0? 5 mg/L、i-肌醇 0? 2 ?400 mg/L、VB3 烟酸 0? 1 ?1. 9 mg/L、对氨基苯甲酸0.3?2.7 mg/L、VB6盐酸批P多醇0.3?4 mg/L、VB2核黄素0.05? 5 mg/L、VBl 盐酸硫胺 0? 05 ?4 mg/L。
8. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含无水 葡萄糖2500?5000mg/L、反丁烯二酸2?8mg/L、2-酮戊二酸10?40mg/L、L-苹果酸 10 ?100mg/L、一水麦芽糖（超纯）500 ?3000mg/L、丁二酸 4 ?14mg/L、Twen80 10 ? 1000mg/L、胆固醇硫酸酯钠盐5?50mg/L、VE钠1?10mg/L、D-鹿糖3000?5000mg/L。
9. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它还包含蛋 白水解物，所述蛋白水解物包含大麦水解物1000?5000mg/L、大米水解物2000?6000mg/ L 〇
10. 权利要求1-9中任一项所述昆虫细胞无血清培养基于培养昆虫细胞或制备重组蛋 白中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种昆虫细胞无血清培养基及其应用。该培养基包含氨基酸、无机盐、维生素和碳水化合物等；进一步的，还包含0.5～15mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱和/或0.1～10mg/L二硬脂酰磷脂酰胆碱；尤其是，还可包含0.001～0.1mg/L二水氯化钡、0.005～0.02mg/L氯化锂、0.05～7mg/L氯化镍。本发明的昆虫细胞无血清培养基组分简单明确，易于制备，成本低廉，且可大幅提升昆虫细胞培养效率和重组蛋白表达效率，利于实现昆虫细胞的大规模培养和重组蛋白的大规模制备。
【IPC分类】C12P21-00, C12N5-07
【公开号】CN104593316
【申请号】CN201510053687
【发明人】张大鹤
【申请人】苏州市沃美生物技术有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月2日