一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测全血或血清样品中端粒酶的 活性程度的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，具有逆转录酶的活 性。其组分包括端粒酶RNA模板（humantelomeraseRNA，hTR)、端粒酶相关蛋白l(human telomeraseassociatedproteinl,hTEPl)以及端粒酶逆转录酶（humantelomerase reversetranscriptase,hTERT)三个部分。研究表明，hTERT是端粒酶的核心，只表达于端 粒酶阳性细胞，并且是端粒酶的限速因子，其mRNA表达水平直接决定端粒酶的活性程度。
[0003] 人类正常体细胞一般无端粒酶活性，而85%?90%的恶性肿瘤可检出端粒酶活 性。人类细胞在胚胎发育早期，端粒酶呈活化状态，随后被抑制并一直处于失活状态，因而 体细胞通常无端粒酶活性或活性很低。当体细胞发生癌变时端粒酶再度活化，以逃避正常 的细胞衰老过程，获得无限增殖的潜能。因而，端粒酶再活化是恶性肿瘤一个显著的生物学 特征。可以通过检测hTERTmRNA的表达水平来确定端粒酶的活性程度，从而诊断待检者是 否患有恶性肿瘤。
[0004] 荧光定量PCR是一项通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检 测，从而实现对起始模板进行定量分析的检测技术。
[0005] 但是，现有技术中这种检测方法还不完善，存在检测灵敏度低的缺点，常导致一部 分患者漏诊，或者出现"假阳性"，给患者带来不便。因此，需要建立一种敏感性高、特异性 好、适用面广的检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程 度的试剂盒，可以准确检测待测样品中端粒酶的活性程度，从而克服现有技术的不足。
[0007] 为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] 检测端粒酶hTERTmRNA表达水平的引物，包括如下引物序列：
[0009] (1)端粒酶hTERT基因的引物序列：
[0010] SEQIDN0:l(hTERT-F) :5, -GGCCGATTGTGAACATGGA-3,；
[0011] SEQIDN0:2(hTERT-R) :5' -CCTCTTTTCTCTGCGGAACGT-3'；
[0012] (2)端粒酶hTERT基因的探针序列：
[0013]SEQIDN0:3(hTERT-P) :5'-TACGTCGTGGGAGCCA-3'，且其 5'端与荧光报告基因相 连，3'端与荧光淬灭基因相连。
[0014] 其中，端粒酶hTERT基因的探针序列5'端连接的荧光报告基团为FAM，3'端连接 的荧光淬灭基团为MGB。
[0015] 上述的检测端粒酶hTERTmRNA表达水平的引物在制备检测全血或血清样品中端 粒酶的活性程度的试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0016] 一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，该试剂盒包括上述端粒 酶hTERT基因的引物（hTERT-F和hTERT-R)和端粒酶hTERT基因的探针（hTERT-P)。
[0017] 其中，该试剂盒还包括如下试剂：总RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量PCR反应 试剂、质控品。
[0018] 其中，所述的总RNA提取试剂的包括如下试剂：
[0019] (1)细胞裂解液Trizol:体积分数为56%的重蒸苯酚，28.2g/L的异硫氰酸胍， 14. 9mmol/L柠檬酸钠溶液，3g/L十二烷基肌氨酸钠，醋酸钠112. 7mmol/L，溶剂为双蒸水；
[0020] ⑵萃取液：氯仿；
[0021] (3)沉淀剂：异丙醇；
[0022] (4)漂洗液：体积分数为75 %的乙醇-;
[0023] (5)RNA溶剂：无RNA酶的水。
[0024] 其中，所述的反转录试剂包括如下组分：
[0025] (1)逆转录反应缓冲液：250mmol/LTris-cl, 375mmol/LKC1,15mmol/LMgCl2, 50mmol/LDTT,pH8. 3；
[0026] (2)dNTP混合物：10mmol/LdATP，lOmmol/LdlTP，lOmmol/LdCTP，lOmmol/L dGTP；
[0027](3)逆转录酶液：20mmol/LTris-cl，200mmol/LNaCl，0?lmmol/LEDTA，1.Ommol/ 1^017，体积分数为50%的甘油，20(^/1^逆转录酶，4(^/1^1?隱酶抑制剂4117.5 ;
[0028] (4)引物混合物：寡脱氧胸苷酸引物，随机6核苷酸引物；
[0029] (5)超纯水：电阻18. 2兆欧。
[0030] 其中，所述的荧光定量PCR反应试剂的包括如下组分：
[0031] (l)RT-PCR反应液：10mmol/LdATP，10mmol/LdlTP，10mmol/LdCTP，lOmmol/ LdGTP，25mmol/LMgCl2,5U/iiLTaqDNA聚合酶，lOOmmol/LTris-cl，500mmol/LKC1， 15mmol/LMgCl2,pH8. 5 ；
[0032] (2)超纯水：电阻18. 2兆欧。
[0033] 其中，所述的质控品包括如下组分：
[0034] (1)阳性质控品：含端粒酶hTERT基因的重组质粒pGM-hTERT，提取纯化浓度为 250mg/mL，拷贝数为 2. 6xl04copies/iiL;
[0035] ⑵阴性质控品：超纯水。
[0036] 上述检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒在制备检测端粒酶活性 程度试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0037] 有益效果：
[0038] 本发明试剂盒与现有技术相比具有如下优势：
[0039] 1、本发明试剂盒适用于荧光定量PCR法检测全血或血清中端粒酶活性程度。
[0040] 2、本发明具有灵敏度高，样本中端粒酶hTERTmRNA表达水平彡10°copies/iiL时， 均可以检测到。
[0041] 3、本发明通过制作标准曲线，实现对样本中端粒酶活性程度的绝对定量。
[0042] 4、本发明检测只需250iiL样本，不仅节省样本，还具有分析时间短，检测后无需 软件分析，可直接读取结果。
【附图说明】
[0043] 图1标准曲线扩增图。
[0044] 图2标准曲线图。
[0045] 图3样本端粒酶hTERT基因扩增图。
【具体实施方式】
[0046] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0047] 以下实施例所用的主要仪器剂厂家如表1所示。
[0048]表1实验仪器及厂家
[0049]
【主权项】
1. 检测端粒酶hTERT mRNA表达水平的引物，其特征在于，包括如下引物序列： (1) 端粒酶hTERT基因的引物序列： hTERT-F :5' -GGCCGATTGTGAACATGGA-3' ； hTERT-R:5' -CCTCTTTTCTCTGCGGAACGT-3' ； (2) 端粒酶hTERT基因的探针序列： hTERT-P :5' -TACGTCGTGGGAGCCA-3'，且其5'端与荧光报告基团相连，3'端与荧光淬灭 基团相连。
2. 根据权利要求1所述的检测端粒酶hTERT mRNA表达水平的引物，其特征在于，端粒 酶hTERT基因的探针序列5'端连接的荧光报告基团为FAM，3'端连接的荧光淬灭基团为 MGB。
3. 权利要求1所述的检测端粒酶hTERT mRNA表达水平的引物在制备检测全血或血清 样品中端粒酶的活性程度的试剂中的应用。
4. 一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包 含权利要求1?2所述的引物。
5. 根据权利要求4所述的检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，其特征 在于，该试剂盒还包括如下试剂：总RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量PCR反应试剂、质 控品。
6. 根据权利要求4所述的检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，其特征 在于，所述的总RNA提取试剂的包括如下试剂： (1)细胞裂解液Trizol :体积分数为56%的重蒸苯酚，异硫氰酸胍28.2g/L，柠檬酸钠 溶液14. 9mmol/L，十二烷基肌氨酸钠3g/L，醋酸钠112. 7mmol/L，溶剂为双蒸水； ⑵萃取液：氯仿； (3) 沉淀剂：异丙醇； (4) 漂洗液：体积分数为75%的乙醇； (5) RNA溶剂：无RNA酶的水。
7. 根据权利要求4所述的检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，其特征 在于，所述的反转录试剂包括如下试剂： (1) 逆转录反应缓冲液：250mmol/L Tris-cl, 375mmol/L KC1,15mmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT, pH8. 3 ； (2) dNTP 混合物：10mmol/L dATP，10mmol/L dTTP，10mmol/L dCTP，10mmol/L dGTP; (3)逆转录酶液：20mmol/LTris-cl，200mmol/LNaCl，0? lmmol/LEDTA,1. Ommol/L DTT，体积分数为50 %的甘油，200U/ ii L逆转录酶，40U/ ii LRNA酶抑制剂，pH7. 5 ; (4) 引物混合物：寡脱氧胸苷酸引物，随机6核苷酸引物； (5) 超纯水：电阻18. 2兆欧。
8. 根据权利要求4所述的检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，其特征 在于，所述的突光定量PCR反应试剂的包括如下试剂： (l)RT-PCR 反应液：10mmol/L dATP，10mmol/L dITP，10mmol/L dCTP，10mmol/L dGTP， 25mmol/L MgCl2, 5U/u L TaqDNA 聚合酶，lOOmmol/L Tris-cl, 500mmol/L KC1,15mmol/L MgCl2, pH8. 5 ； (2)超纯水：电阻18. 2兆欧。
9. 根据权利要求4所述的检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，其特征 在于，所述的质控品包括如下组分： (1) 阳性质控品：含端粒酶hTERT基因的重组质粒pGM-hTERT，提取纯化浓度为250mg/ mL，拷贝数为 2. 6xl04copies/ y L ; (2) 阴性质控品：超纯水。
10. 权利要求4?9所述的检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒在制备 检测端粒酶活性程度试剂中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，属于分子生物学检测领域，该试剂盒包含如下引物：(1)端粒酶hTERT基因的引物序列：hTERT-F：5’-GGCCGATTGTGAACATGGA-3’；hTERT-R：5’-CCTCTTTTCTCTGCGGAACGT-3’；(2)端粒酶hTERT基因的探针序列：hTERT-P：5’-TACGTCGTGGGAGCCA-3’，且其5’端与荧光报告基因相连，3’端与荧光淬灭基因相连。利用该试剂盒检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度具有检测灵敏度高，分析时间短，稳定性好的优点。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104593505
【申请号】CN201510033954
【发明人】赵冬梅, 于嘉屏
【申请人】上海迪安医学检验所有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月23日