一种灵芝孢子活性成分的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物与化妆品领域，具体涉及灵芝孢子活性成分的提取方法，以及 灵芝孢子活性成分在抗衰老产品中的应用。
【背景技术】
[0002] 灵芝，又称之为灵芝草、仙草等，原产于亚洲东部，中国分布最广的在江西。灵芝属 于担子菌亚门、多孔菌目、多孔菌科、灵芝菌属的真菌。李时珍在《本草纲目》中指出，灵芝 有"增智慧，好颜色"之功效，灵芝是一种具有抗皱、消炎、清除色斑、保护皮肤的真菌。灵芝 含有抑制黑色素的成分及多种对皮肤有益的微量元素等，这些成分能够通过减少人体自由 基，加速细胞的再生，增加皮肤的厚度并增加胶原质，达到丰润皮肤、消除细纹与皱纹的效 果。其中的多糖成分能够通过保持和调节皮肤水性，恢复皮肤弹性，使皮肤湿润、细腻。近 年来，大家对灵芝中的灵芝酸、灵芝多糖及灵芝多肽的提取及药用价值研宄颇多，而真正提 取灵芝孢子活性成分的很少，更别提将其应用于抗衰老产品中。本发明主要研宄灵芝孢子 活性成分的分离以及该活性成分在抗衰老产品中的应用。
[0003] 灵芝孢子长在灵芝菌盖中，成熟后由灵芝菌管弹射出来，一些会落在菌盖表面，一 些会飘洒在四周。对于灵芝孢子，其呈褐色、卵形（8. 5?11.2) ymX (5. 2-6. 9) ym，具双层 壁。且灵芝孢子包裹的两层壁十分坚韧，一般的化学，物理方法很难将其打破，故限制了对 其化学成分、生物活性成分的研宄。建立有效的破壁方法，可以促进对其生物活性成分的提 取、药用价值及抗衰老方面的研宄。
[0004] 现有的破壁方法主要有两种：一是生物破壁法，以无菌的灵芝孢子粉加入蛹虫草 进行固体发酵，使灵芝孢子粉破壁。由于其制备过程中需要经过长时间的发酵，而且发酵 后必须经过固液分离，干燥，才能得到破壁后的灵芝孢子粉，工艺较为复杂，容易引入其它 杂质，破坏灵芝孢子的营养成分。二是机械粉碎法，精选灵芝孢子粉，添加20?80%的水， 50°C干燥12h以上，放入罐体，球料比（2-3) :1，球料占罐体的四分之三左右，球磨时间4? 9h，大珠、中珠、小珠的个数比例为1:1: 1，进行破壁处理，得破壁灵芝粉。此种方法球磨效率 一般，破壁率较低，球磨过程中对于营养成分的损失较大，且容易引入重金属元素。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种更为有效的破壁方法，即先 将灵芝孢子用质量浓度为0. 2-0. 5 %果胶酶和质量浓度为0. 2-0. 5 %纤维素酶联合消化 后，再将干冰和无水乙醇的组成混合溶液将温度控制在（_6〇°C )-(-20°C )，采用超声波机 械粉碎破碎的方法破碎灵芝孢子细胞壁，从而有效得到灵芝孢子活性成分。并将灵芝孢子 活性成分进行纯化冻干，应用在抗衰老产品中。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：
[0007] -种灵芝孢子活性成分的提取方法，将准备好的灵芝孢子进行以下处理：
[0008] (1)软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0. 2-0. 5%纤维素酶和质量浓度为 0. 2-0. 5%果胶酶组成的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁；
[0009] (2)低温真空干燥：将灵芝孢子置于（_60°C )-(-20°C )的干冰和无水乙醇的混合 溶液中保存，真空干燥处理；
[0010] (3)低温破壁：在（_60°C )-(-20°C )下对灵芝孢子用超声波进行机械粉碎破壁， 得到灵芝孢子提取物。
[0011] 优选的，软化所述灵芝孢子壁3-8小时。
[0012] 优选的，所述灵芝孢子低温保存时间为1-5小时。
[0013] 优选的，将所述灵芝孢子置于干冰和无水乙醇的混合物中，并优选为_20°C的条件 下，采用超声波进行机械粉碎破壁。本发明中采用的机械粉碎破壁方法相对传统的机械粉 碎方法其时间更短，破壁率更高，可充分使灵芝孢子内部有效活性成分释放，提高了灵芝孢 子制品的应用价值。
[0014] 所述灵芝孢子的准备包括以下步骤：
[0015] (1)收集：人工培养灵芝结束后，收集灵芝孢子；
[0016] (2)筛选：将灵芝孢子用筛网进行过滤；
[0017] (3)漂洗：用水冲洗过滤后的灵芝孢子。
[0018] 优选的，所述灵芝孢子筛选采用200目以上的筛网进行过滤。
[0019] 一种将权利要求1的灵芝孢子提取物制成灵芝孢子活性成分冻干粉的方法，包括 以下步骤：
[0020] (1)过滤：收集灵芝孢子提取液，用孔径小于0. 45yM的滤膜过滤；
[0021] (2)浓缩：浓缩上清液，浓缩至浓缩液中蛋白浓度为50±0. 5 y g/ml ;
[0022] (3)过滤：经浓缩液采用孔径小于0. 22 y M的滤膜过滤；
[0023] (4)冻干处理：冻干温度为（_20°C )-(_35°C)，真空度为50-200Pa，冻干时间为 24-36小时，即得到灵芝孢子活性成分冻干粉。
[0024] 所述的灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶护品中应用，尤其是在化妆品中的应 用。所述抗衰老扶护品即不局限于在面霜、面膜、乳液、洗面乳、爽肤水、眼霜等化妆品或其 它抗衰老产品中的应用。能有效达到祛痘、消除痘痕、除皱、去细纹等的效果。
[0025] 所述灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶护品中的添加量为1-5 y g/ml。
[0026] 有益效果：
[0027] 1、破碎灵芝孢子细胞壁时间短。本发明结合了双酶溶液和低温机械法软化并破碎 灵芝孢子细胞壁的方法，即先用纤维素酶和果胶酶联合软化灵芝孢子壁，然后在低温环境 中对灵芝孢子进行机械粉碎破壁处理。有效缩短了破碎灵芝孢子细胞壁的时间，大大的提 高了灵芝孢子的破壁率。
[0028] 2、本发明提取的灵芝孢子活性成分对人皮肤成纤维细胞无毒、无副作用，能有效 应用于抗衰老产品中。本发明将灵芝孢子活性成分应用于抗衰老产品中，如面膜、面霜、乳 液等化妆品，有效达到祛痘、消除痘痕、除皱、去细纹等的效果。
【附图说明】
[0029] 图1为灵芝孢子活性成分的提取及应用流程图；
[0030] 图2为灵芝孢子活性成分冻干粉水溶液对人皮肤成纤维细胞（HSF)增殖活力的影 响。
【具体实施方式】
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。
[0032] 图1为灵芝孢子活性成分的提取及应用流程图。下面结合实施例进一步说明。
[0033] 实施例1
[0034] 一种灵芝孢子活性成分的提取方法，包括以下步骤：
[0035] 1、灵芝孢子的培育
[0036] (1)本发明采用斜面培养基培养灵芝菌种（购自中国普通微生物菌种保藏管理中 心，编号为CGMCC 5. 616)。该斜面培养基为马铃薯葡萄糖（PDA)琼脂培养基，具体配方见表 1。灵芝菌种的培养条件是：培养温度28°C，湿度暗培养，培养时间为7天。
[0037] 表1马铃薯葡萄糖（PDA)琼脂培养基配方
[0038]
【主权项】
1. 一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，将准备好的灵芝孢子进行以下处 理： (1) 软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0. 2-0. 5 %纤维素酶和质量浓度为 0. 2-0. 5%果胶酶组成的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁； (2) 低温真空干燥：将灵芝孢子置于（_60°C )-(-20°C )下保存，真空干燥处理； (3) 低温破壁：在（_60°C )-(_20°C )下对灵芝孢子进行机械粉碎破壁，得到灵芝孢子 提取物。
2. 根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，软化所述 灵芝孢子壁3-8小时。
3. 根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述灵芝 孢子低温保存时间为1-5小时。
4. 根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，将所述灵 芝孢子置于干冰和无水乙醇的混合物中，采用超声波进行机械粉碎破壁。
5. 根据权利要求1所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述灵芝 孢子的准备包括以下步骤： (1) 收集：人工培养灵芝结束后，收集灵芝孢子； (2) 筛选：将灵芝孢子用筛网进行过滤； (3) 漂洗：用水冲洗过滤后的灵芝孢子。
6. 根据权利要求5所述的一种灵芝孢子活性成分的提取方法，其特征在于，所述灵芝 孢子筛选采用200目以上的筛网进行过滤。
7. -种将权利要求1的灵芝孢子提取物制成灵芝孢子活性成分冻干粉的方法，其特征 在于包括以下步骤： (1) 过滤：收集灵芝孢子提取液，用孔径小于0. 45 μ M的滤膜过滤； (2) 浓缩：浓缩上清液，浓缩至浓缩液中蛋白浓度为50 ±0. 5 μ g/ml ; (3) 过滤：经浓缩液采用孔径小于0. 22 μ M的滤膜过滤； (4) 冻干处理：冻干温度为（_20°C )-(_35°C )，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36 小时，即得到灵芝孢子活性成分冻干粉。
8. 权利要求7所述的灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶护品中应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗衰老扶护品为面膜、爽肤水、面霜、乳 液、眼箱、洗面乳。
10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述灵芝孢子活性成分冻干粉在抗衰老扶 护品中的添加量为1-5 μ g/ml。
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝孢子活性成分的提取方法及其应用，提取方法包括以下步骤：(1)软化处理：将灵芝孢子浸泡在质量浓度为0.2-0.5％纤维素酶和质量浓度为0.2-0.5％果胶酶组成的混合酶溶液里，软化灵芝孢子壁；(2)低温真空干燥；(3)低温破壁：在低温环境下对灵芝孢子进行机械粉碎破壁。本发明结合了双酶溶液和低温机械法软化并破碎灵芝孢子细胞壁的方法，有效减低了破碎灵芝孢子细胞壁的难度且缩短了时间。本发明提取的灵芝孢子活性成分对人皮肤成纤维细胞无毒、无副作用，能有效应用于抗衰老化妆产品中。如面膜、面霜、乳液等化妆品，有效达到祛痘、消除痘痕、除皱、去细纹等的效果。
【IPC分类】A61Q19-10, C12N1-06, A61Q19-00, A61K8-02, C12R1-645, A61Q19-08, A61K8-99
【公开号】CN104611226
【申请号】CN201410718505
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 罗二梅, 王小燕, 马岩岩
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年11月28日