从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(sod)的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及到一种从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺。
【背景技术】
[0002]辣木为多年生木本植物，原产于印度北部喜马拉雅山地区，是一种具有很高食用和药用价值的热带植物。大量研宄证明，辣木叶含有丰富的蛋白质、总黄酮以及超氧化物歧化酶(SOD)等多种功效成分。辣木叶的蛋白质含量高达27%，约为牛奶的2倍；辣木叶所含的超氧化物歧化酶(SOD)具有清除自由基、调节甲状腺素和肝脂过氧化作用。近年来，辣木在我国广东、云南和海南等地都广为引种栽培，其相关产品的开发成为热点。但是，国内对于辣木的研宄主要集中在栽培技术和营养成分分析方面，至今未见有关从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)工艺的专利报道。
[0003]在现有的其他植物叶蛋白的提取工艺中，一般采用加热处理来提取分离叶蛋白，这种方法既消耗大量能源，又很容易造成被提取的叶蛋白变性，复水溶解性差，消化率不高，商业应用价值低。因此，研制开发一种从植物叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的新工艺具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的正是基于上述状况而提出的一种从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，该工艺以丰富的辣木鲜嫩叶为原料，工艺简单，安全可靠，易于实施，所提取的蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)可作为有关食品和医药工业的新原料，具有较高的实用价值。
[0005]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现的:从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，其工艺步骤如下:
(1)取新鲜辣木叶经过除杂清洗，加入辣木鲜叶重量2?8倍的缓冲液，粉碎打浆，在常温下不断搅拌，浸提I?4小时，压榨过滤，收集滤液；
(2)将步骤(I)所得滤液进行高速离心分离，收集上清液(I);
(3)取步骤(2)所得上清液(I)，调整其PH值至4.9?5.2，于O?4°C下静置30?40分钟后，高速离心，分别收集沉淀物(I )和上清液(II);
(4)将步骤(3)所得沉淀物(I)加入去离子水搅拌溶解，得超氧化物歧化酶(SOD)粗品溶液，将SOD粗品溶液加热升温至42°C，用2N NaOH溶液调整PH值至9.0，并滴加SOD粗品溶液总质量0.01%?0.05%的修饰保护剂，保温反应I小时后，快速冷却至30°C以下，离心，收集上清液，用IN HCl调整PH值至6.5?7.0，快速升温至60?70°C，不断搅拌，保温处理10分钟后，快速冷却至30°C以下，离心，收集上清液即SOD精品溶液；
(5)取步骤(4)所得SOD精品溶液，边搅拌边缓慢加入SOD精品溶液体积1.2?1.8倍的预冷过的95%乙醇，于O?4°C下静置10?15分钟后，离心，收集沉淀物，再用去离子水溶解，离心，收集上清液，冷冻干燥，即得超氧化物歧化酶(SOD)精品冻干粉；
(6)取步骤(3)所得上清液(II)，用IN HCl溶液调整PH值至4.0?4.3，于O?4°C下静置30?40分钟后，高速离心，收集沉淀物(II)，用缓冲液溶解，喷雾干燥，即得辣木叶蛋白粉。
[0006]上述步骤(I)中的缓冲液为PH值6.5?7.6、浓度为20mmol/L?200mmol/L、含5mo I/L EDTA和20mmol/L焦亚硫酸钠的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(Na2HPO4-KH2PO4)缓冲液。
[0007]上述步骤(2)中的高速离心分离技术是采用连续离心机离心，转速大于15000r/min，离心 20 ?40min。
[0008]上述步骤(3)中的高速离心分离技术是采用连续离心机离心，转速大于15000r/min,离心 20 ?40min。
[0009]上述步骤(4)中的修饰保护剂是月桂酰氯。
[0010]上述步骤(6)中的高速离心分离技术是采用连续离心机离心，转速大于15000r/min,离心 20 ?40min ;缓冲液为 PH 值 6.5 ?7.6、浓度为 20mmol/L ?200mmol/L、含 5 mol/L EDTA和20mmol/L焦亚硫酸钠的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(Na2HPO4-KH2PO4)缓冲液。
[0011]本发明的优点在于:
(1)采用含有还原剂和螯合剂的磷酸缓冲液浸提辣木叶，大大提高了叶蛋白质的溶解度和浸出率，最大限度地避免或减轻了提取过程中叶蛋白的氧化变性和超氧化物歧化酶(SOD)的活性损失，从而大大提高了最终产物叶蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的纯度和产量；
(2)采用等电点沉淀和离心分离技术，无需加热处理即可有效提取分离辣木叶蛋白质和超氧化物歧化酶(S0D)，不仅解决了目前国内专利报道的植物叶蛋白提取过程中的蛋白质热变性和损失问题，而且可以节省能源，大大降低了生产成本，提高了经济效益；
(3)采取先修饰保护后热变性处理的方法来实现超氧化物歧化酶(SOD)粗酶液的纯化，使纯化操作更简便，除杂效果更好，SOD酶活性更高；
(4)本发明得到的叶蛋白粉色泽好，水溶性好，蛋白质含量达到85%以上，质量稳定，可用作食品添加剂。所获得的超氧化物歧化酶(SOD)活性高，单位酶活达到3000U/mg以上，可用于保健食品、化妆品和医药工业原料；
(5)本发明工艺简单易行，成本低，安全可靠，适合大规模工业化生产。
【附图说明】
[0012]附图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0013]下面列举实施例，结合附图1将具体操作步骤做进一步描述:
(1)称取经过除杂清洗的辣木鲜叶50公斤，加入鲜叶重量4倍的PH值6.8、浓度为100mmol/L、含5 mol/L EDTA和20mmol/L焦亚硫酸钠的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(Na2HPO4-KH2PO4)缓冲液，粉碎打浆，在常温下不断搅拌，浸提3小时。浸提浆液经板框压滤机压榨过滤(滤布150目、过滤压力0.15MPa)，收集滤液180L ；
(2)取滤液180L，经连续离心机16000rpm离心30min，去沉淀物，获得上清液(I) 155L ；
(3)取上清液(I)155 L，用IN HCl调整其PH值至5.0，于O?4°C下静置30分钟后，经连续离心机16000rpm离心30min，分别收集沉淀物(I ) 1.5Kg和上清液(II) 148L ；
(4)取沉淀物(1)1.5Kg，加入4倍沉淀物重量的去离子水，搅拌溶解，得超氧化物歧化酶(SOD)粗品溶液，将SOD粗品溶液分装到不锈钢容器中，于水浴锅中快速升温至42°C，然后用2N NaOH溶液调整其PH值至9.0，滴加SOD粗品溶液总质量0.02%的修饰保护剂月桂酰氯，不断搅拌，保温并维持粗酶液PH9.0不变，反应I小时后，快速冷却至30°C以下，6000rpm离心lOmin，去除沉淀物杂质，收集上清液，用IN HCl调整PH值至6.5，快速升温至65°C，不断搅拌，保温反应10分钟后，快速冷却至30°C以下，6000rpm离心lOmin，收集上清液，即得SOD精品溶液4.3L ；
(5)取SOD精品溶液4.3L，加入其体积1.5倍的4°C以下预冷过的95%乙醇，边加边缓慢搅拌，于O?4°C下静置10分钟后，3000rpm离心lOmin，收集SOD精品沉淀，再用去离子水溶解，6000rpm离心lOmin，收集上清液，冷冻干燥，即得淡蓝色辣木叶超氧化物歧化酶(SOD)精品冻干粉662mg，经采用微量邻苯三酚法(325nm法)检测活性，SOD酶活性为3120U/mg 干粉；
(6)取上清液(II)148L，用IN的HCl调整其PH值至4.2，于O?4°C下静置30分钟后，用连续离心机16000rpm离心30min，收集沉淀物(II) 5.1kg ；
(7)将沉淀物(II)5.1kg加入3倍重量的PH值6.8、浓度为100mmol/L、含5 mmol/LEDTA和20mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(Na2HPO4-KH2PO4)缓冲液，搅拌溶解，喷雾干燥，即得白色辣木叶蛋白粉956g，蛋白质含量为87.2%，产品收得率为鲜叶重量的1.91%。
【主权项】
1.从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，其特征在于:包括以下工艺步骤: (1)取辣木新鲜叶，除杂清洗，加入辣木鲜叶重量2?8倍的缓冲液，粉碎打浆，在常温下搅拌浸提I?4小时，压榨过滤，收集滤液； (2)将步骤(I)所得滤液进行高速离心分离，收集上清液； (3)取步骤(2)所得上清液，调整PH值至4.9?5.2，于O?4°C下静置30?40分钟后，高速离心，分别收集沉淀物和上清液； (4)取步骤(3)所得沉淀物，加入去离子水溶解，得超氧化物歧化酶(SOD)粗品溶液，将SOD粗品溶液加热升温至42°C，用2N NaOH溶液调整PH值至9.0，滴加SOD粗品溶液总质量0.01%?0.05%的修饰保护剂，搅拌，保温反应I小时后，快速冷却至30°C以下，离心，收集上清液，用IN HCl调整PH值至6.2?6.8，快速升温至60?70°C，不断搅拌，保温处理10分钟后，快速冷却至30°C以下，离心，收集上清液； (5)取步骤(4)所得上清液，边搅拌边缓慢加入上清液体积1.2?1.8倍的预冷过的95%乙醇，于O?4°C下静置10?15分钟后，离心，收集沉淀，再用去离子水溶解，离心，收集上清液，冷冻干燥，即得超氧化物歧化酶(SOD)精品冻干粉； (6)取步骤(3)所得上清液，用INHCl溶液调整PH值至4.0?4.3，于O?4°C下静置30?40分钟后，高速离心，收集沉淀，用缓冲液溶解，喷雾干燥，即得辣木叶蛋白粉。
2.根据权利I要求所述的从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，其特征在于:上述步骤(I)中的缓冲液为PH值6.5?7.6、浓度为20mmol/L?200mmol/L、含5 mmol/L EDTA和20mmol/L焦亚硫酸钠的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(Na2HPO4-KH2PO4)缓冲液。
3.根据权利I要求所述的从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，其特征在于:上述步骤(2)中的高速离心分离技术是采用连续离心机，转速大于15000r/min，离心20?40min。
4.根据权利I要求所述的从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，其特征在于:上述步骤(3)中的高速离心分离技术是采用连续离心机，转速大于15000r/min，离心20?40min。
5.根据权利I要求所述的从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，其特征在于:上述步骤(4)中的修饰保护剂是月桂酸酰胺。
6.根据权利I要求所述的从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺，其特征在于:上述步骤(6)中的高速离心分离技术是采用连续离心机，转速大于15000r/min，离心 20 ?40min，缓冲液为 PH6.5 ?7.6、20mmol/L ?200mmol/L、含 5 mmol /T, EDTA 和20mmol/L焦亚硫酸钠的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(Na2HPO4-KH2PO4)缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了从辣木叶中提取蛋白质和超氧化物歧化酶(SOD)的工艺。将新鲜辣木叶粉碎打浆，浸提，压滤，等电点沉淀，离心后得到沉淀物和上清液；对沉淀物进行修饰保护、热变性反应、冷冻干燥处理得超氧化物歧化酶(SOD)冻干粉；上清液经等电点沉淀、离心、喷雾干燥制得叶蛋白粉。本发明采用常温下浸提、等电点沉淀、修饰保护和离心分离等技术方法，最大限度地保持了蛋白质原有的功能特性和酶的活性，提高了蛋白质和活性酶的产量，得到的叶蛋白粉色泽好，蛋白质含量高，质量稳定，得到的超氧化物歧化酶(SOD)活性高，具有较高的实用价值和经济效益。本发明操作简单，生产成本低，安全可靠，适合工业化生产。
【IPC分类】C07K1-14, C07K14-415, C12N9-02
【公开号】CN104611310
【申请号】CN201510103929
【发明人】陈石良
【申请人】陈石良
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年3月10日