山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物及其鉴定方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 山稻在我国具有悠久的栽培历史，分布广泛，尤以云南、贵州等少数民族聚居地为 多，主要采用游耕性质的刀耕火种生产方式。长期的自然选择和人工培育，形成了我国丰富 的山稻种质资源。近年来，随着林下经济的发展，建设各种规模大、效益好、带动力强的林下 经济发展模式，已成为国家对发展林下经济所要实现的主要目标。然而长期以来，中国山稻 主产地的山稻生产、销售一直较为混乱，"异种同名、同种异名"现象普遍存在，特别是一些 优良品种频繁被假冒而出现在山稻种质资源市场上，极大地损害了山稻育种者和生产者的 利益。因而对于山稻品种，建立一种简便、快速、可靠的优良品种鉴定技术尤为迫切。
[0003] 分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与成熟，为发展简便、快 速、准确的菌种鉴定技术提供了有效手段。一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）在上个世纪90年代已用于各类物种的分类鉴定上， 但这些标记用于山稻品种的鉴定均不够理想。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region,特征性片段扩增区域）标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出 的，它基于对特异RAro片段的测序，根据两端序列设计一对18?24碱基的引物，在较高的 退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞 争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物，以及一种能对山稻 百灵谷14号进行快速鉴定的方法。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：
[0007] 上游引物：5，-AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3，，
[0008] 下游引物：5，-GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3，。
[0009] 该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得山稻百灵谷14号的特异性DNA 片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该特异性引物 对山稻品种进行PCR扩增，仅山稻百灵谷14号可获得903bp的特异性片段，其他山稻品种 均不能获得特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于山稻品种的鉴 定（鉴定其是否为山稻百灵谷14号），即待测样品仅限于山稻。
[0010] 本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对山稻百灵谷14号进行快速 鉴定的方法，所述方法为：提取待测山稻品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特 异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现 903bp的特异DNA条带，则待测山稻品种为山稻百灵谷14号，反之则否；所述分子特异性标 记引物序列为：
[0011] 上游引物：5，-AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3，，
[0012] 下游引物：5，-GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3，。
[0013] 本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定， 以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
[0014] 优选的，本发明所述PCR扩增体系组成如下：
[0015] PCR Buffer 终浓度为I x dNTPs I mmol/L MgCl2 2.5mmol/L Taq DNA 酶 2.5U 上、下游引物 各1.25μΜ 模板 DNA 60ng
[0016] 余量为 ddH20;
[0017] PCR扩增条件如下：
[0018] 先 94°C 预变性 6min ;
[0019] 92°C变性 40s、56°C退火 40s、72°C延伸 2min，共 30 个循环；
[0020] 最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
[0021] PCR Buffer终浓度为IX，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与 IXPCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的IOXPCR Buffer。IOXPCR Buffer 成分为：100mM Tris-HCl (pH 8. 5)、500mM KCl、25mM MgCljP 1.0% Triton-X-100， 溶剂为ddH20。
[0022] 具体的，所述方法如下：
[0023] (1)取待测山稻叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测山稻叶片的基因组 DNA ；
[0024] (2)以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标
[0025] 记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
[0026] PCR扩增体系每20 μ L组成如下：
[0027] IOxPCR Buffer 2μ【 lOmmol/L dNTPs 2\\L 25mmol/L MgC^ 2pL 5U/pL Taq DNA 酶 0.5pL 25μΜ上、下游引物 各IpL 20ng/pL 模板 DNA 3pL
[0028] ddH20 补足至 20 μ L ;
[0029] PCR扩增条件如下：
[0030] 94°C预变性6min ;92°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后 于72°C补平7min，终止温度为4°C ;
[0031] (3)取步骤⑵扩增产物5 μ L，与1 μ L 0. 25 %溴酚兰缓冲液混勻，点样于1. 5% 的琼脂糖凝胶上，于I X TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶 图像分析仪上照相，若电泳结果出现903bp的DNA条带，则待测山稻品种为山稻百灵谷14 号，反之则否。
[0032] 本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对山稻百灵谷14号 进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别山稻品种所不能替代的分子 手段。 (四）
【附图说明】
[0033] 图1为对山稻品种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；箭头所指为从编号 为23号的山稻百灵谷14号品种扩增出的分子量为IOOObp左右大小的特殊DNA条带；其余 编号为其它常用的山稻生产品种，未见有IOOObp左右大小的特异DNA条带产生。 (五）
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0035] 实施例1 :
[0036] (1)基因组DNA的提取：基因组DNA的提取采用以SDS-CTAB法进行提取。纯化的 基因组DNA先用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA紫外分光光度计定量检 测。DNA提取物于-20°C冰箱贮藏备用。
[0037] (2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物 5' -AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3'和下游引物5' -GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3'，由上海生 工生物工程技术有限公司合成。
[0038] (3) SCAR分子标记的PCR扩增：
[0039] PCR扩增体系每20 μ L组成如下：
[0040] IOxPCR Buffer 2μ? lOmmol/L dNTPs 2μ? 25mmol/L MgCh 2pL 5U4iLTaqDNA 酶 0·5μ? 25μΜ上、下游引物 各IpL 20ng/pL 模板 DNA 3μΙ^
[0041] ddH20 补足至 20 μ L ;
[0042] 扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。
[0043] PCR扩增条件如下：
[0044] 94°C预变性6min ;92°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后 于72°C补平7min，终止温度为4°C ;
[0045] (4)电泳检测：取步骤（3)PCR扩增产物5ul，与Iul 0· 25%溴酚兰缓冲液混匀， 点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含 0. 5 μ g/mlEB的水溶液中染色30分钟，然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。
[0046] 按照上述方法，分别对24种水稻或山稻（编号1?24代表山稻及水稻品种依次 为：1 :甬优538 ;2 :百灵谷12号；3 :中旱221 ;4 :百灵谷15号；5 :春江119 ;6 :百灵谷10号； 7 :杂交岳伏9113 ;8 :百灵谷16号；9 :百灵谷4号；10 :百灵谷18号；11 :百灵谷2号；12 : 百灵谷5号；13 :百灵谷19号；14 :百灵谷1号；15 :百灵谷3号；16 :百灵谷9号；17 :百灵 谷7号；18 :百灵谷6号；19 :百灵谷13号；20 :百灵谷17号；21 :百灵谷20号；22 :百灵谷 11号；23 :百灵谷14号；24 :百灵谷8号）进行检测，电泳结果见图1。
[0047] 其中编号23为山稻百灵谷14号品种，扩增出一条清晰明亮、稳定的分子量为 IOOObp左右大小的特殊DNA条带，其余编号为其他常用的山稻生产品种，未见有IOOObp左 右大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异 性标记用于山稻百灵谷14号的鉴定，其稳定性好、特异性高。
【主权项】
1. 山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下： 上游引物：5 ' -AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3 '， 下游引物：5 ' -GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3 '。
2. -种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对山稻百灵谷14号进行快速鉴定 的方法，所述方法为：提取待测山稻品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标 记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现903bp的 特异DNA条带，则待测山稻品种为百灵谷14号，反之则否；所述分子特异性标记引物序列 为： 上游引物：5 ' -AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3 '， 下游引物：5 ' -GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3 '。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94°C预变性6min; 92°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温 度为4°C。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： ⑴取待测山稻叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测山稻叶片的基因组DNA; (2) 以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物， 进行PCR扩增： PCR扩增体系每20iiL组成如下： l〇xPCRBuffer 2uL lOmmol/L dNTPs2\xL 25minol/LMgCh 2uL 5U/p.LTaqDNA酶0 5pL25|iM上、下游引物 各l|iL 20ng/|iL模板DNA 3|xL ddH20 补足至 20yL; PCR扩增条件如下： 94°C预变性6min;92°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于 72°C补平7min，终止温度为4°C; (3) 取步骤（2)扩增产物5iiL，与1iiL0. 25 %溴酚兰缓冲液混匀，点样于1. 5 %的琼 脂糖凝胶上，于1XTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像 分析仪上照相，若电泳结果出现903bp的DNA条带，则待测山稻品种为百灵谷14号，反之则 否。
【专利摘要】本发明涉及一对特异性高的山稻百灵谷14号的分子特异性标记引物，以及一种能对山稻百灵谷14号进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCTCGAGCTAACC-3′，下游引物：5′-GGTTAGCTCGAGCGGCCGCT-3′。本发明分子特异性标记引物可对山稻百灵谷14号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别山稻品种所不能替代的分子手段。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104611438
【申请号】CN201510049991
【发明人】王丽玲, 刘本同, 秦玉川, 钱华, 王衍彬
【申请人】浙江省林业科学研究院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月30日