一种检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎（TGEV)是一种高度接触传染性肠道疾病，不同日龄、品种的猪均 可感染发病，对哺乳仔猪尤为严重，常导致整窝仔猪发病，发病率和死亡率高，病势依日龄 而异，日龄越小，死亡率越高。两周龄以下仔猪发生呕吐，严重水样腹泻，有时呈喷射状，发 生腹泻的猪圈有腥臭气味，猪全身被毛被粪便污染，粪便中含有未消化的凝乳片而呈现乳 白色或灰白色；在发病后期的猪只粪便变粘稠，猪只消瘦，体重减轻；一般3-7天死亡，10日 龄内的仔猪的死亡率可达80% -100%。育肥猪常引起整圈猪只发病，有水样腹泻，粪便中 带有未消化的食物，猪圈中有腥臭味。一般一周可以恢复健康，病死率较低，但影响饲料报 酬，对我国养猪业造成严重的经济损失。病死仔猪的主要剖检病理变化为：胃内容物常充满 而显庞大，小肠肠管扩张，肠壁变薄呈半透明状；用手术剪剪开胃部可见有白色的乳凝块， 胃底黏膜充血；小肠内容物呈黄绿色或灰白色，可见白色的乳凝块，有少量泡沫性粘液，小 肠组织显微镜下可见小肠绒毛萎缩变短。
[0003] 传统的检测方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过长。公开号103740860A 的专利申请公开了一种PCR检测猪传染性胃肠炎的方法，其能够检测的猪传染性胃肠炎的 最低检测限为35fg/ μ L，即875copiess/ μ L，灵敏度低。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可检测猪传染性胃 肠炎病毒的试剂盒。
[0005] 本发明检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO :1?2所示引物对， 扩增猪传染性胃肠炎病毒基因。
[0006] 其中，所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO :3所示。
[0007] 其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO :3所示基因片段。
[0008] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1?2所示引物对在扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因 中的用途。
[0009] 其中，所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO :3所示。
[0010] 其中，所述试剂还包括SEQ ID NO :3所示基因片段。
[0011] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1?2所示引物对在制备检测猪传染性胃肠炎病毒的 试剂中的用途。
[0012] 其中，所述检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂是扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因的 试剂。
[0013] 其中，所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO :3所示。
[0014] 本发明试剂盒可以有效检测猪传染性胃肠炎病毒，灵敏度高，最低检测浓度为 6. 37c〇pieS/ μ L，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。
[0015] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0016] 图1重组质粒TGEV-N的PCR结果（泳道4、5、6为目的N基因）。
[0017] 图2荧光定量PCR退火温度优化溶解曲线图。
[0018] 图3荧光定量PCR扩增曲线。
[0019] 图4荧光定量PCR标准曲线。
[0020] 图5荧光定量PCR特异性实验结果。
[0021] 图6荧光定量PCR灵敏度试验结果。
【具体实施方式】
[0022] 一、实验材料和仪器
[0023] 1病毒及主要试剂与材料
[0024] 市售TGEV弱毒疫苗参考株（CV777株）、猪流行性腹泻病病毒、猪轮状病毒、猪乙 脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒，购自中国兽药监察所或由本实验室保存；大 肠埃希菌DH5 α由本实验室制备并保存；蓝白斑鉴定试剂盒、pMD19-T(Simple)、DL2000DNA Marker载体等购自大连宝生物有限公司；DNA凝胶回收试剂盒（200)、质粒小量提取试剂 盒购自OMEGA生物技术公司；反转录试剂盒、2XTaq PCR MasterMix、RealMasterMix(SYBR Green)购自天根生物技术公司；其他化学试剂均为国产分析纯。临床腹泻病料来自四川各 地发病猪场的疑似PEDV感染病料。
[0025] 2主要仪器设备
[0026] MyCyclerTM PCR 仪，日本 TaKaRa 公司；
[0027] POWER Pac TM凝胶电泳装置，上海BIO-RAD公司；
[0028] UNIVERSAL HOOD紫外凝胶成像系统，BI0-RAD，意大利产；
[0029] Mini Opticon实时荧光定量PCR系统，上海宝生物公司；
[0030] SCILOEEX D2008E离心机，上海安亭科学仪器厂；
[0031] 309987-2997 C02 恒温培养箱，Thermo 公司；
[0032] SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
[0033] SmartSpec Plus Spectrophotometer (分光光度计），BIO-RAD 公司。
[0034] 电热恒温水浴槽；振荡培养箱；漩涡振荡器。
[0035] 3主要试剂配制
[0036] LB培养基
[0037] SOC培养基
[0038] 实施例1本发明试剂盒的制备
[0039] 1、材料和仪器
[0040] 同前述实验材料和仪器。
[0041] 2、实验方法
[0042] 2. 1荧光定量PCR引物设计
[0043] 根据本实验室分离的TGEV SC-H株的全序列，应用生物信息学软件对TGEV全序列 进行分析，选取TGEV SC-H株的N基因作为靶序列设计3对荧光定量引物（表1)，并送上海 生工生物工程有限公司合成。
[0044] 表1荧光定量RCR引物
[0045]
【主权项】
1. 一种检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO :1?2所 示引物对，扩增猪传染性胃肠炎病毒基因。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO :3 所示。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQ ID NO :3所示 基因片段。 4. SEQ ID NO :1?2所示引物对在制备检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂中的用途。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂是 扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因的试剂。
6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO :3 所示。
7. 根据权利要求1所述的的用途，其特征在于：所述试剂还包括SEQ ID NO :3所示基 因片段。 8. SEQ ID NO :1?2所示引物对在扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因中的用途。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO :3 所示。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～2所示引物对，扩增猪传染性胃肠炎病毒基因。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测猪流行性腹猪传染性胃肠炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN104611465
【申请号】CN201510059374
【发明人】黄小波, 文心田, 李蕊彤, 曹三杰, 文翼平, 伍锐, 李亚青, 邓丽, 卿盈, 张雨迪, 陈杰
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月4日