类酵母共生菌及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，涉及一株类酵母共生菌的分离及防治灰飞風新方 法的探索。 技术背景
[0002] 灰飞風Lao沁7如油S紅ia妃/7化属于半翅目化emiptera)飞風科（Del曲acidae), 是一种重要的农业害虫，除W刺吸危害水稻、大麦、小麦等作物外，还传播水稻条纹叶枯病、水 稻黑条矮缩病和玉米粗缩病等病毒病，造成作物产量损失巨大（下锦华和苏建亚，2001)。目 前对灰飞風的防治主要基于杀虫剂的使用。但由于长期大量和不合理地使用杀虫剂，导致目 前灰飞風对很多杀虫剂产生了不同程度的抗性（王彦华等，2010)，而人们为提高杀虫效果则 不断加大杀虫剂的使用剂量，如此形成恶性循环，不仅飞風难W得到防治，同时对环境和非祀 标生物产生了严重的危害。因此寻找新的防治途径，有效减少化学杀虫剂的使用是灰飞風防 治的关键。
[0003] 研究发现类酵母共生菌（yeast-1化e symbiotes,化S)是存在于飞風腹部脂肪体 中的共生菌，已有报道它与褐飞風的氨基酸代谢化oyama，1985)，营养提供息息相关化ee and化U，1987)，对褐飞風的生长、发育、繁殖、致害性变化等方面起到重要作用（吕仲贤等， 2001a ;b)。已有研究发现经过高温处理后的灰飞風，体内的共生菌数量明显减少，最终导致 灰飞風的耐药性减弱（张晓捷等，2008)。杀菌剂相比杀虫剂具有毒性低，祀标性强等特点， 因此，杀菌剂与杀虫剂的协同使用将成为防治飞風的一种新途径，在不影响杀虫效果甚至 提高杀虫效果的情况下，将大大减少化学杀虫剂的使用。CN 103918701A、CN 103918702 A、 CN 103918703 A，公开了针对于类酵母共生菌的褐飞風防治的混合配方制剂和制备方法， 但杀菌剂的筛选还缺少理论依据，随机因素很大，另外杀虫剂的用量偏高，可能造成生态影 响。而且，由于缺少理论依据，褐飞風防治对灰飞風的防治缺乏指导作用。
[0004] 明确灰飞風体内共生菌的多样性，W及共生菌的离体培养及生理特性的研究可 为灰飞IT抑菌防虫"和杀菌剂的选择提供依据。陈法军等（2006)通过冷冻切片和显微 观察初步认为，灰飞風体内存在多种化S;本研究组前期通过分子检测生物学技术证明 灰飞風体内有化S，如No da菌巧取(9聲ces cA/yso巧76/邸和季也蒙毕赤酵母菌巧cAia 皿W出i的存在（白旭等，2010)。由于人们很难模拟昆虫体内的微环境，因此化S 的离体培养非常困难。Kusumi等（1979)曾离体培养得到几株灰飞風化S，但未见对其进行 准确鉴定和特性研究。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一株类酵母共生菌及用途。
[0006] 第一个目的在于首次通过体外培养分离灰飞風体内类酵母共生菌-异常毕赤酵 母。
[0007] 本发明的第二个目的明确了异常毕赤酵母作为生物标记物。
[0008] 本发明的第H个目的是通过异常毕赤酵母生理生化特性及其不同杀菌剂的敏感 性实验，筛选可显著抑制异常毕赤酵母，从而降低灰飞風活性的杀菌剂。
[0009] 本发明的第四个目提供一种提高灰飞風防治效果的新手段和新药剂。
[0010] 本发明的目的是通过W下技术手段得W实现： 一株类酵母共生菌，菌株SP2014分类命名为异常毕赤酵母（A'cAia a/7(9ffl37a)SP2014， 已于2014年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中也，保藏编号为；CCTCC NO: M 2014534,地址为：中国武汉武汉大学，邮编；430072,该菌株对杀菌剂安泰生、拿敌稳敏感， 当安泰生浓度为400 mg/L时，异常假丝酵母不能生长，当拿敌稳浓度达到800 mg/L时， 异常假丝酵母不能生长，而银力法与施佳乐的抑制效果不明显，当两者浓度分别达到5000 mg/L时，异常假丝酵母仍可生长。
[0011] 所述的异常假丝酵母通过体外培养从灰飞風的体内分离得到。
[0012] 所述的体外培养过程如下；在无菌条件下，解剖灰飞風腹部收集脂肪体，均匀涂布 于YPD固体培养基上，放置于28。C恒温培养箱中培养。
[0013] 一种所述的类酵母共生菌的用途，作为监测灰飞風活力的指示标记物。
[0014] 一种所述的类酵母共生菌的用途，作为筛选或创制防治灰飞風杀虫剂的用途。
[0015] 一种用于防治灰飞風的混合药物，包括针对异常毕赤酵母的杀菌剂和针对灰飞風 的杀虫剂，所述的杀菌剂选自安泰生、拿敌稳，杀虫剂为化虫晰。
[0016] 所述的杀菌剂配制成拿敌稳水分散粒剂，安泰生可湿性粉剂，所述的化虫晰为化 虫晰水分散粒剂。
[0017] 所述的拿敌稳水分散粒剂，有效成分质量浓度为75%，其中巧菌醋占25%，戊哇醇 占50% ;将化虫晰水分散粒剂和拿敌稳水分散粒剂分别用蒸觸水溶解，混合，配成终浓度为 0. 4g/L拿敌稳和0. 004g/L化虫晰混合配方。
[0018] 本发明的有益效果： 本发明通过体外培养从灰飞風体内筛选到一株类酵母共生菌异常毕赤酵母，W此菌作 为指示微生物，筛选对其有明显抑制作用的杀菌剂，将此杀菌剂协同杀虫剂使用防治灰飞 風，不仅减少了化学杀虫剂的使用，同时提高了防治效果。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明异常毕赤酵母菌的平板培养图； 图2是NS1/NS8扩增产物电泳图； 图3是系统进化树； 图4是PCR扩增DGGE图谱。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1;(巧cAia <3/?(9磁7<3的体外分离与鉴定） 灰飞風从杭州周边稻田采集后饲养于人工气候箱中（温度26 +rC，相对湿度80 + 5%, 光照时间16L:8D)，W大麦苗继代饲养50代W上。取刚羽化的灰飞風雌虫10头，用75%的 酒精表面消毒3次，每次3min，无菌水漂洗3次，每次3min，在超净工作台剖取其腹部脂 肪体并收集。将收集好的脂肪体分别加入YPD，PDA, YM，Candia Elective Agar培养基中， 涂布均匀，放置于28°C恒温培养箱中培养4她后观察并记录结果。在有菌长出的培养基上， 用接种环挑取单菌落，加入到相应的液体培养基中，28°C，180r/min摇床培养2化。重复3 次。
[0021] 在离体培养实验所用的5种培养基中，只有YTO培养基分离得到了一株类酵母共 生菌（图1)，该菌株呈乳白色，表面光滑并伴有芳香气味。在抑2~12下均可生长，最适抑 为7。12种碳源的同化的结果见表1，与酵母分类手册（Kudzman ef a7.，2011)中异常毕 赤酵母菌的描述基本一致。
[0022] 表1异常毕赤酵母菌在氮基础培养基上的碳源同化结果
【主权项】
1. 一株类酵母共生菌，其特征在于：菌株SP2014分类命名为异常毕赤酵母（ a/?o?ah)SP2014,已于2014年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为： CCTCC NO: M 2014534,该菌株对杀菌剂安泰生、拿敌稳敏感，当安泰生浓度为400 mg/L时， 异常假丝酵母不能生长，当拿敌稳浓度达到800 mg/L时，异常假丝酵母不能生长，而银力法 与施佳乐的抑制效果不明显，当两者浓度分别达到5000 mg/L时，异常假丝酵母仍可生长。
2. 如权利要求1所述的类酵母共生菌，其特征在于：所述的异常假丝酵母通过体外培 养从灰飞虱的体内分离得到。
3. 如权利要求2所述的类酵母共生菌，其特征在于：所述的体外培养过程如下：在无 菌条件下，解剖灰飞虱腹部收集脂肪体，均匀涂布于YPD固体培养基上，放置于28° C恒温 培养箱中培养。
4. 一种如权利要求1所述的类酵母共生菌的用途，其特征在于：作为监测灰飞虱活力 的指示标记物。
5. -种如权利要求1所述的类酵母共生菌的用途，其特征在于：作为筛选或创制防治 灰飞虱杀虫剂的用途。
6. -种用于防治灰飞虱的混合药物，其特征在于：包括针对异常毕赤酵母的杀菌剂和 针对灰飞風的杀虫剂，所述的杀菌剂选自安泰生、拿敌稳，杀虫剂为批虫琳。
7. 如权利要求6所述的混合药物，其特征在于：所述的杀菌剂配制成拿敌稳水分散粒 剂，安泰生可湿性粉剂，所述的吡虫啉为吡虫啉水分散粒剂。
8. 如权利要求7所述的混合药物，其特征在于：所述的拿敌稳水分散粒剂，有效成分 质量浓度为75%，其中肟菌酯占25%，戊唑醇占50% ;将吡虫啉水分散粒剂和拿敌稳水分散粒 剂分别用蒸馏水溶解，混合，配成终浓度为〇. 4g/L拿敌稳和0. 004g/L吡虫啉混合配方。
【专利摘要】本发明公开了类酵母共生菌及用途。类酵母共生菌是通过体外培养技术从灰飞虱脂肪体内分离得到的，经微生物分类学鉴定，命名为异常毕赤酵母（Pichia anomala）SP2014，2014年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2014534。通过其对不同杀菌剂敏感性的研究分析，本发明将对P. anomala SP2014抑制效果明显的安泰生、拿敌稳这两种杀菌剂以800 mg/L浓度喷施麦苗，灰飞虱取食后的死亡率分别达到46.7%与63.3%，显著高于对照，而体重比对照组显著低。荧光定量检测结果表明，灰飞虱体内类酵母共生菌数量在使用杀菌剂后显著降低。可作为监测灰飞虱活力的指示标记物或者作为筛选或创制防治灰飞虱杀虫剂的用途。CCTCC NO: M 201453420141031
【IPC分类】A01P7-04, A01N47-14, A01N37-50, A01N43-653, C12R1-84, A01P3-00, C12N1-16, C12Q1-04, C12Q1-18, A01N51-00
【公开号】CN104630081
【申请号】CN201510031142
【发明人】马正, 俞晓平, 曹伟, 边亚琳, 许益鹏, 郝培应
【申请人】中国计量学院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月22日