可视化红色荧光杆状病毒的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术、λ Red重组系统，尤其涉及一种利用基因重组技术构建一种重组杆状病毒的方法。
【背景技术】
[0002]适用于杆状病毒的λ Red重组系统是目前高效快速构建重组杆状病毒的系统之一，之前主要利用该系统敲除或者缺失杆状病毒基因组中的某个基因，以研宄该基因的功能。该系统的主要组成包括含有经改造能在细菌中增殖的杆状病毒基因组bacmid(中文名称为“杆状病毒质粒”)和编码重组酶的PKD46质粒的大肠杆菌BW25113菌株和扩增抗性基因所需的质粒模板(例如PKD3或者p2ZeoKS)。其产生重组病毒的原理是:首先，通过PCR或者酶切连接构建含有与重组片段两侧相同的同源臂序列，同源臂序列内部的抗性基因(例如氯霉素或者博莱霉素抗性基因)用来替代目标重组片段，将构建的线性片段电转进大肠杆菌BW25113感受态细胞，在重组酶的作用下，抗性基因便会替代基因组中同源臂内的基因序列，从而使目标基因失活，并且可以通过抗生素筛选得到重组成功的杆状病毒bacmid，将抽提的bacmid转染来自于所用杆状病毒的宿主的相应的昆虫细胞系，便可获得重组病毒。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种可视化红色荧光杆状病毒的构建方法。
[0004]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是:在杆状病毒的核衣壳蛋白的羧基末端融合I?3个分子的红色荧光蛋白，由此重组得到可视化红色荧光杆状病毒。
[0005]进一步地，本发明所述红色焚光蛋白为mCherry。
[0006]进一步地，本发明所述核衣壳蛋白为VP39。
[0007]进一步地，本发明所述红色荧光蛋白为3个。
[0008]进一步地，本发明的构建方法包括如下步骤:
(1)通过酶切连接构建重组质粒，其重组片段包括:杆状病毒的上游同源序列和下游同源序列，杆状病毒的核衣壳蛋白的编码基因的自身启动子，所述核衣壳蛋白的编码基因的开放阅读框，I?3个分子的红色荧光蛋白的开放阅读框，编码氯霉素乙酰转移酶的抗性筛选基因(缩写为cat);其中，优选使用3个分子的红色荧光蛋白，红色荧光蛋白优选为mCherry，所述核衣壳蛋白优选为VP39 ；
(2)对所述重组质粒酶切获得完整的线性重组片段，将所述线性重组片段电转进大肠杆菌BW25113的感受态细胞，所述感受态细胞含有杆状病毒基因组bacmid和编码重组酶的PKD46质粒，然后涂板获得重组成功的杆状病毒基因组bacmid ；
(3)将重组的杆状病毒基因组bacmid转染进来自于所述杆状病毒的宿主的昆虫细胞系，获得重组杆状病毒。
[0009]进一步地，本发明所述抗性筛选基因优选为来自PKD3质粒的氯霉素乙酰转移酶基因(缩写为mi)。
[0010]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明利用λ Red重组系统，将核衣壳蛋白编码基因滿虫合红色荧光蛋白基因后引入杆状病毒基因组，这样产生的重组病毒自身带有红色荧光标签，无需抗体或者荧光素标记，便可在荧光下观测到单个病毒粒子的定位和运动，从而可以利用红色荧光蛋白观测和追踪病毒粒子的行踪。该重组杆状病毒为研宄杆状病毒侵染宿主的详细感染进程创造了条件。
【附图说明】
[0011]图1是VP39_3mCherry重组线性片段构建示意图，其中，KanR表示bacmid本身具有的卡那霉素抗性，mi表示编码氯霉素乙酰转移酶的抗性基因；
图2是重组病毒注射家蚕96小时后气管组织的感染情况；
图3是重组病毒注射家蚕96小时后精巢组织的感染情况。
【具体实施方式】
[0012]以下以具体的实例进一步说明本发明。在以下实例中，重组病毒的构建是基于目前已有的λ Red重组系统，通过在杆状病毒的主要核衣壳蛋白VP39的羧基末端融合三分子的红色荧光蛋白mCherry构建而成，产生的重组病毒自身带有红色荧光标签，无需抗体或者荧光素标记，便可在荧光下观测到单个病毒粒子的定位和运动。该重组杆状病毒为研宄杆状病毒侵染宿主的详细感染进程创造了条件。在以下实例中，利用的是适用于家蚕核型多角体病毒的λ Red重组系统，所用细胞系为从家蚕卵巢组织分离的BmN细胞系。需要说明的是，在本发明中，适用于其他核型多角体病毒的λ Red重组系统和昆虫细胞系也可以用于构建可视化红色荧光杆状病毒；红色荧光蛋白也可以由其他易于识别和观察的有色荧光蛋白等同替代。
[0013]1.材料:家蚕卵巢细胞系BmN ;适用于家蚕核型多角体病毒的λ Red重组系统；含有红色荧光蛋白mCherry的开放阅读框的质粒和含有编码氯霉素乙酰转移酶(缩写为cat')抗性筛选基因的pKD3质粒；购自日本Takara公司的各种限制性内切酶、连接酶等分子生物学操作试剂。
[0014]2.构建方法:
参见图1，本发明可视化红色荧光杆状病毒的构建方法包括如下步骤:
(1)通过酶切连接构建重组质粒，其重组片段包括:上游同源序列(家蚕核型多角体病毒 BmNPV 的 42，213 - 42，706 nt 序列)和下游同源序列(BmNPV 的 42，718 - 43，248 nt序列)，因的自身启动子，KA?难]开放阅读框，三分子的红色焚光蛋白mCherry的开放阅读框，编码氯霉素乙酰转移酶的抗性筛选基因(缩写为mi)，各片段从左到右的位置如图1所示，其中上游同源序列和下游同源序列的位置固定，红色荧光蛋白的开放阅读框必须紧邻核衣壳蛋白的编码基因的开放阅读框的后面；
(2)对所述重组质粒酶切获得完整的线性重组片段，将所述线性重组片段电转进大肠杆菌BW25113的感受态细胞，所述BW25113菌株的感受态细胞含有家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组bacmid、并含有编码重组酶的pKD46质粒，然后涂板获得重组成功的家蚕核型多角体病毒基因组bacmid ； (3)将重组的家蚕核型多角体病毒基因组bacmid转染进家蚕细胞系BmN，获得重组后的家蚕核型多角体病毒BmNPV。
[0015]由此得到的重组家蚕核型多角体病毒BmNPV，因其核衣壳带有了红色荧光蛋白mCherry而成为可视化红色荧光杆状病毒。在显微镜下如果看到红色，即可判断该重组病毒的出现和所在位置。
[0016]应用实例:用以上得到的重组家蚕核型多角体病毒BmNPV经血淋巴注射家蚕五龄幼虫，在注射后96小时，剖取家蚕各组织在荧光显微镜下观察重组病毒的感染情况(红色荧光)，如图2、3所示。
[0017]由图2和图3可见明显的红色荧光，分别为图2中的区域I及区域2和图3中的区域3。由此说明，病毒能够在家蚕幼虫的气管组织中增殖，并证实病毒已通过气管感染了其他细胞和组织。
[0018]综上可见，按照本发明方法构建重组的可视化红色荧光杆状病毒，由于产生的重组病毒自身带有红色荧光标签，无需抗体或者荧光素标记，便可在荧光下观测到单个病毒粒子的定位和运动，从而可以利用红色荧光蛋白观测和追踪病毒粒子的行踪，为研宄杆状病毒侵染宿主的详细感染进程创造了条件。
【主权项】
1.一种可视化红色荧光杆状病毒的构建方法，其特征在于: 在杆状病毒的核衣壳蛋白的羧基末端融合I?3个分子的红色荧光蛋白，由此重组得到可视化红色荧光杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于:所述红色焚光蛋白为mCherry。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于:所述核衣壳蛋白为VP39。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于:所述红色荧光蛋白为3个。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于:所述红色荧光蛋白为3个。
6.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)通过酶切连接构建重组质粒，其重组片段包括:杆状病毒的上游同源序列和下游同源序列，杆状病毒的核衣壳蛋白的编码基因的自身启动子，所述核衣壳蛋白的编码基因的开放阅读框，I?3个分子的红色荧光蛋白的开放阅读框，编码氯霉素乙酰转移酶的抗性筛选基因； (2)对所述重组质粒酶切获得完整的线性重组片段，将所述线性重组片段电转进大肠杆菌BW25113的感受态细胞，所述感受态细胞含有杆状病毒基因组bacmid和编码重组酶的PKD46质粒，然后涂板获得重组成功的杆状病毒基因组bacmid ； (3)将重组的杆状病毒基因组bacmid转染进来自于所述杆状病毒的宿主的昆虫细胞系，获得重组杆状病毒。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于:所述核衣壳蛋白为VP39。
8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于:所述抗性筛选基因为来自于PKD3质粒的氯霉素乙酰转移酶基因。
9.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于:所述红色荧光蛋白为3个。
10.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于:所述核衣壳蛋白为VP39，所述抗性筛选基因为来自于PKD3质粒的氯霉素乙酰转移酶基因，所述红色荧光蛋白为3个。
【专利摘要】本发明公开了一种可视化红色荧光杆状病毒的构建方法，即：在杆状病毒的核衣壳蛋白的羧基末端融合1～3个分子的红色荧光蛋白，由此重组得到可视化红色荧光杆状病毒。本发明通过红色荧光蛋白标记病毒的核衣壳蛋白，使病毒带有红色荧光从而可视化，由此可根据红色荧光的出现判断病毒的位置，追踪杆状病毒粒子的行踪。本发明重组病毒的构建为探究杆状病毒在培养细胞和幼虫组织中的详细侵染过程创造了条件。
【IPC分类】C12N15-85, C12N15-54, C12N7-01, C12N15-65, C12R1-93
【公开号】CN104630271
【申请号】CN201510060324
【发明人】沈运旺, 张健家, 吴小锋
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月5日