水稻恶苗病菌的pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种水稻病害的检测方法，尤指一种检测水稻恶苗病（rice bakanae) 的PCR (聚合酶链式反应）方法。
【背景技术】
[0002] 水稻恶苗病是水稻病害之一，是由藤仑赤霉菌（无性态为藤仑镶抱菌）侵染引起 的真菌病害，该病常见症状是稻株徒长，水稻孕穗期后造成病株及周围植株长霉枯死，严重 影响了水稻的产量。
[0003] 研究表明水稻恶苗病菌可经种子传带，因此种子带菌检测就显得格外重要。对于 水稻种子是否携带有病原真菌，W前主要通过对种子所携带的微生物进行分离培养，再根 据培养物所产生抱子的形态特征进行鉴定。该种方法不仅分离培养时间长，同时也由于杂 菌污染影响分离效果，检出效率不高。因此，有必要建立一种能准确鉴定水稻恶苗病菌的快 速分子检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是；针对上述现有技术的不足，提供一种能准确鉴定 水稻恶苗病菌的PCR检测方法。该方法所使用的一对引物是对水稻恶苗病菌特异的，本检 测方法所使用的该对引物有别于其它检测方法，能快速检测出水稻种子中的恶苗病菌。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种用于PCR检测水稻恶 苗病菌的特异性引物，所述特异性引物为：
[0006] 正向引物；5-TGCCCGGGAATGACTTTGAA-3, SEQ ID No. 1 ;
[0007] 反向引物；5-GCATCACAGCAATGGAGGAC-3,沈Q ID No. 2。
[000引上述特异性引物的设计是基于水稻恶苗病菌赤霉素生物合成相关基因的核巧酸 序列。
[0009] 本发明同时提供一种水稻恶苗病菌的PCR检测方法，该方法是用上述设计的水稻 恶苗病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。
[0010] 对本发明方法详细叙述如下：
[0011] 一、引物设计：
[0012] 本发明人利用真核生物进化过程中核酸序列的保守性，从NCBI捜索并下载水稻恶 苗病菌（F'usarium fujikuroi)菌系IMI 58289的赤霉素生物合成相关基因（gibberellin biosynthesis-related gene)的核巧酸序列（序列登录号 emb|HF679025.1|)，运用 prime巧LAST设计引物，并经BLAS化进行检验，找出其它真菌序列均与之不同的引物候选 区，设计出一对引物（由宝生物工程（大连）有限公司合成）：
[001 引 正向引物；5-TGCCCGGGAATGACTTTGAA-3(SEQ ID No. 1);
[0014] 反向引物；5-GCATCACAGCAATGGAGGAC-3(SEQ ID No. 2);
[0015] 将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，结合参见图1及图2，结果表明，与正向 引物和反向引物的序列100 %覆盖且100 %相同的全部是水稻恶苗病菌的核巧酸序列。
[0016] 二、DNA 的提取；
[0017] 采取下述方法提取带水稻恶苗病菌的水稻种子DNA :
[001引 （1)将SDS分离缓冲液置于60°C水浴中预热。
[0019] (2)称取0.5g菌丝，置于预冷的研鉢中，倒入液氮，尽快将菌丝研碎。（或加预热 的SDS分离缓冲液，用石英砂研磨）
[0020] (3)将粉末装入无菌1. 5血的离屯、管中，加入600uL预热的SDS分离缓冲液中，轻 轻转动使之混匀。
[0021] (4)样品于 65°C保温 lOmin。
[00巧 妨加等体积的7. 5mol/L的化化，轻轻颠倒混匀。
[002引 （6)冰浴 8min，10000;rpm 离屯、5min。
[0024] (7)取600uL上清液至EP管中，加等体积化OOuL)的氯仿-异戊醇（24:1)，轻轻 颠倒混匀，10000巧m离屯、10分钟。
[0025] (8)将上层水相吸入另一干净的离屯、管中，加入0. 1倍体积的NaAc和2体积的预 冷无水己醇（或1倍体积的预冷异丙醇），轻轻混匀，-20°C冰箱放置比，使核酸沉淀下来。
[0026] (9)收集 DNA ;10000巧111 离屯、lOmin，去上清。
[0027] (10)70%酒精洗漆，洗漆2次。
[00測 （11)酒精挥发后，用0. 1倍TE或(1化0溶解，-20°c分装保存备用。
[0029] S、PCR 过程；
[0030] 采用上述引物对对带水稻恶苗病菌的水稻种子的DNA进行PCR检测。预期PCR产 物为29化P。
[003U PCR反应体系为25 yl，具体见下表1 ;
[0032] 表1PCR反应体系各主要成分及用量
[0033]
【主权项】
1. 一种用于PCR检测水稻恶苗病菌的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为： 正向引物：5-TGCCCGGGAATGACTTTGAA-3 ; 反向引物：5-GCATCACAGCAATGGAGGAC-3。
2. 如权利要求1所述的用于PCR检测水稻恶苗病菌的特异性引物，其特征在于，所述特 异性引物的设计是基于水稻恶苗病菌赤霉素生物合成相关基因的核苷酸序列。
3. -种水稻恶苗病菌的PCR检测方法，其特征在于：该方法是用权利要求1或2中任 一项所述的水稻恶苗病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。
4. 如权利要求3所述的水稻恶苗病菌的PCR检测方法，其特征在于：所述PCR产物大 小为295bp。
【专利摘要】一种水稻恶苗病菌的PCR检测方法，是以水稻恶苗病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物是基于水稻恶苗病菌赤霉素生物合成相关基因的核苷酸序列，是水稻恶苗病菌的赤霉素生物合成相关基因序列特异的，本检测方法所使用的这对引物有别于其它检测方法，可以用于快速检测出水稻，从而可以检测出水稻种子是否携带有恶苗病菌。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-04, C12N15-11
【公开号】CN104630369
【申请号】CN201510076984
【发明人】高必达, 周倩
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月13日