一种乳腺癌miRNA检测试剂盒及其miRNA的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种miRNA的检测产品W及miR-21、miR-191和miR-16作为乳腺癌分 子标记物的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有200万新增乳腺癌患者；我国 近年乳腺癌发病率增长迅速，高出发达国家1-2个百分点，且具有年轻化、家族聚集、遗传 易感等特征。乳腺癌早早期时临床无症状，隐匿阶段平均为12年，等到有明显症状时多已 是中晚期。
[0003] 应用分子指标来早期发现肿瘤是目前的研究热点，其中微小RNA (mi croRNA， miRNA)作为早期诊断的新一代肿瘤标志越来越引起临床应用的关注。miRNA是一类高度保 守，长度约在19 - 24个核巧酸的内源性非编码小分子单链RNA，能通过与祀基因mRNA特 异性的碱基互补配对，引起祀基因mRNA的降解或者抑制其翻译，从而参与调控细胞增殖、 分化及调亡过程，一些miRNA作为原癌基因或抑癌基因已被证实。lorio等的研究（Cancer Res, 2005,65 (16) ,7065-7070)首次指出，miRNA在乳腺癌和正常的乳腺组织中的表达存在 着明显的差异。Seon曲0 等的研究（Plos one，2011,6(2)，el6403)利用 Illumina-S〇]_-exa 深度测序平台的基因检测技术在乳腺癌细胞株中鉴定的189种明显异常的miRNA,该些 miRNA均有不同程度的致癌潜能。miRNA对于早期癌症的诊断具有重要意义。Mar-Aguilar F的研究（Asia Pac J Clin Oncol. 2013,9(1) :53-9)显示miRNA的联合表达分析比起单个 miRNA分析在预测乳腺癌中的优势；miR-12化和miR-191的联合检测敏感度为100%，特异 性为94%;miR-21和miR-191联合检测敏感度为92%，特异性为100%。"miR-21、miR-155 在乳腺癌血清和肿瘤组织中表达水平相关性的研究"（卞国奉，2012，硕±论文）也指出血 清中miR-21和miR-155联合检测在乳腺癌早期诊断中的潜在价值。
[0004] 血清中的miRNA含量远低于组织，需要一种非常灵敏且特异的检测方法；又由于 miRNA引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可W直接利用，故引物及体系均 需筛选及优化过程。目前对miRNA的高通量筛查一般采用巧片技术，成本高、特异性和灵敏 度有限，且不能满足零散标本实时检测需求；对少数miRNA的实时检测多采用化qman探针 法，部分已形成商业化试剂盒产品，但成本和售价高昂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测快速方便、准确率高，可W实现乳腺癌早期诊断的 miRNA检测试剂盒，W及提供miR-21、miR-191和miR-16联合使用作为乳腺癌分子标记物 的应用。
[0006] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是；miR-21、miR-191、miR-16和 miR-39联合使用在制备乳腺癌miRNA检测试剂盒中的应用，其中miR-39作为内参。
[0007] 基于上述应用本发明提出的具体技术方案是；一种乳腺癌miRNA检测试剂盒， 其检测体系包括反转录反应体系、RCR反应体系和内参体系，所述RCR反应体系中包括分 别针对miR-21、miR-191和miR-16的正向引物和反向通用引物；所述内参体系包括内参 miRNA-39和针对miR-39的正向引物；针对所述miR-21的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示；针对所述miR-191的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 2所示；针对所述 miR-16的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 3所示；针对所述miR-39的正向引物的核 巧酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述反向通用引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[000引用于配制所述RCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通 用引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺巧酸聚合酶、反转录酶 混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。
[0009] 上述RCR反应体系的总体积为10 y 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是 5 y 1，所述正向引物液的体积是1 y 1，所述反向通用引物液的体积是1 y 1，所述DNA模板 1 y 1，其余是纯水；所述正向引物液的使用浓度为2 UM，所述反向通用引物液的使用浓度 为2 y M ;所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释五倍获得的。
[0010] 上述反转录反应体系的总体积为12.5U1 ;其中，所述多聚腺巧酸聚合酶的体积 是0. 5 y 1，所述反转录酶混合液的体积是0. 5 y 1，所述反转录缓冲液的体积是2. 5 y 1，所 述miRNA样品的加入量是20ng，其余是无核酸酶纯水；所述多聚腺巧酸聚合酶的使用浓度 为2. 5U/ y 1 ;所述miRNA样品中含有内参miRNA-39。
[0011] 上述内参miRNA-39是在抽提miRNA样品过程中加入的体积为2 y 1的内参 miRNA-39液，所述内参miRNA-39的使用浓度为0. 2 y M。
[0012] 本发明具有积极的效果：
[0013] (l)miR-21、miR-191和miR-16作为组合分子标记物，经过大数据临床验证实验， 在乳腺癌的辅助诊断指标方面具有突出优势。该=个分子标记物首次应用于乳腺癌miRNA 检测试剂盒的开发，该乳腺癌miRNA检测试剂盒运用实时巧光定量PCR方法，可W实现早期 乳腺癌的辅助诊断，提高患者的生存率。
[0014] (2)本发明的乳腺癌miRNA检测试剂盒选择了 miR-21、miR-191和miR-16该S个 miRNA标记物进行组合，开发成检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低， 可W满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。
[0015] (3)本发明的乳腺癌miRNA检测试剂盒针对血清中作为定量反应的内参，不同样 本中差异很大的因素，特别引入稳定的外源RNA序列miR-39(来源于线虫）作为内参对照 RNA，并优化设计了针对miR-39的内参正向引物，极大提高了进行miRNA检测时相对定量的 准确度。
【附图说明】
[0016] 图1是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-21的烙解曲线图；
[0017] 图2是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-191的烙解曲线图；
[001引图3是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-16的烙解曲线图；
[0019] 图4是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-39的烙解曲线图；
[0020] 图5是采用本发明的试剂盒分别进行miR-21、miR-191和miR-16单指标及S个指 标联合检测的R0C曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是W下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 W根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[00巧实施例1
[0023] 一、试剂盒的组成。
[0024] 本实施例的乳腺癌miRNA检测试剂盒，包括用于配制反转录反应体系的试剂、用 于配制PCR体系的试剂和用于配制内参体系的试剂。
[0025] 1、内参体系：
[0026] 用于配制内参体系的试剂包括内参miRNA-39液和针对miR-39的正向引物液。内 参 miRNA-39 液为现虫 cel-miR-39 (Accession Number ;AJ487564)溶液，由英潍捷基（上 海）贸易有限公司合成，封装在一个小瓶中，配制的浓度为20yM，共lOyl，使用浓度为 0. 2 yM ;针对miR-39的正向引物液封装在一个小瓶中，体积是100 y 1，使用浓度为2 yM。 如表1所示。
[0027] 表1内参体系组分表 [002引
【主权项】
1. miR-21、miR-191和miR-16联合使用作为乳腺癌分子标记物的应用。 2. miR-21、miR-191、miR-16和miR-39联合使用在制备乳腺癌miRNA检测试剂盒中的 应用，其中miR-39作为内参。
3. 如权利要求2所述的乳腺癌miRNA检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、 RCR反应体系和内参体系，其特征在于：所述RCR反应体系中包括分别针对miR-21、miR-191 和miR-16的正向引物和反向通用引物；所述内参体系包括内参miRNA-39和针对miR-39 的正向引物；针对所述miR-21的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；针对所述 miR-191的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；针对所述miR-16的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；针对所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
4. 根据权利要求3所述的乳腺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于：用于配制所述RCR反 应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水；用于配制所 述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核 酸酶纯水。
5. 根据权利要求4所述的乳腺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于：所述RCR反应体系 的总体积为1〇μ1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5μ1，所述正向引物液的体积是 ?μL，所述反向通用引物液的体积是?μL，所述DNA模板?μL，其余是纯水；所述正向引物液 的使用浓度为2μΜ，所述反向通用引物液的使用浓度为2μΜ ;所述DNA模板是所述反转录反 应体系反应后的产物稀释五倍获得的。
6. 根据权利要求4所述的乳腺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于：所述反转录反应体 系的总体积为12. 5μ1 ;其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的体积是0. 5μ1，所述反转录酶混合液 的体积是〇. 5μ1，所述反转录缓冲液的体积是2. 5μ1，所述miRNA样品的加入量是20ng，其余 是无核酸酶纯水；所述多聚腺苷酸聚合酶的使用浓度为2. 5υ/μ1 ;所述miRNA样品中含有内 参 miRNA-39。
7. 根据权利要求4所述的乳腺癌miRNA检测试剂盒，其特征在于：所述内参miRNA-39 是在抽提miRNA样品过程中加入的体积为2 μL的内参miRNA-39液，所述内参miRNA-39的 使用浓度为〇. 2μΜ。
【专利摘要】本发明涉及miR-21、miR-191和miR-16联合使用作为乳腺癌分子标记物的应用；涉及miR-21、miR-191、miR-16和miR-39联合使用在制备乳腺癌miRNA检测试剂盒中的应用；涉及一种乳腺癌miRNA检测试剂盒，RCR反应体系中包括分别针对miR-21、miR-191和 miR-16的正向引物和反向通用引物；内参体系中包括内参miRNA-39和针对miR-39的正向引物；针对miR-21的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对miR-191的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；针对miR-16的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；针对miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明的乳腺癌miRNA检测试剂盒检测快速方便、准确率高，可以辅助乳腺癌早期诊断。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104630377
【申请号】CN201510090768
【发明人】赵新泰, 王明
【申请人】上海赛安生物医药科技有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月28日