一种产酸性α-淀粉酶的酵母菌株及其发酵产酶方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种野生型酵母菌SH3 iRhodotorula sp.SH3)产酸性α -淀粉酶的菌种及其优化发酵工艺条件，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖，广泛应用于食品、酿造、制药、纺织及石油开采等诸多方面，在工业生产中占有极其重要的地位，是目前用途较广泛的一种酶制剂。据不完全统计，全球酶制剂产业不断发展，其中淀粉酶制剂已占30%左右。目前工业生产应用的α-淀粉酶耐热温度在95°C左右，pH多为中性偏酸性，而工业生产过程中自然淀粉浆的pH在3.2-4.5之间，因此需要在酸性条件下依然具有高酶活的α-淀粉酶。开发酸性淀粉酶将有助于解决液化酶和糖化酶适用pH值差异的难题。
[0003]微生物发酵是目前酸性α-淀粉酶生产的核心途径。国外对微生物发酵产酸性α_淀粉酶的研宄起步较早，1963年发现可用真菌生产酸性α-淀粉酶。我国对产α_淀粉酶菌株的研宄起步较晚，尤其是产耐酸性α-淀粉酶菌种，长期被国外垄断。开发具有自主知识产权的生产菌株，提高耐酸性α -淀粉酶的产量和性能，对满足国内市场需求、调整我国酶制剂工业结构、拓宽市场、带动相关食品或发酵行业的发展等具有重要意义，在我国现代工业酶制剂中占有显著地位。
[0004]随着分子生物学的发展，利用基因工程手段获得优良基因工程菌株是一种主要手段，能够从理性设计的角度来达到菌种优化的目的。但具有自主产权的菌种的筛选，以及其发酵工艺的确定，仍然是相关领域技术开发和行业发展的关键。目前产酸性α -淀粉酶的菌种主要有芽孢杆菌、酵母、丝状真菌等。
【发明内容】
[0005]本发明解决的技术问题之一是提供的一种产酸性α -淀粉酶的酵母菌株及其发酵产酶方法，该菌株为红酵母sp.) SH3，于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所，菌种保藏号为CGMCC N0.10503。为从面粉厂污水排出口附近土壤中分离筛选的一株酵母菌SH3 (Rhodotorula sp.SH3)。
[0006]酵母菌SH3的筛选方法是从面粉厂周边土壤中经平板菌落特征并比较透明圈大小初筛，采用摇瓶发酵复筛，经酶活测定，比较酸性α -淀粉酶的活性大小而得到。
[0007]初筛培养基:牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，琼脂粉15 g/L ο使用前将pH调至5.0o
[0008]复筛培养基:胰蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉 10 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L，KH2PO4 3 g/L，CaCl2 0.2 g/L, pH 调至 5.0。
[0009]所述菌株为野生型菌株，该菌株的18S ITS序列已提交GenBank数据库，登录号为KM875707。
[0010]本发明解决的另一技术问题是利用酵母菌SH3 iRhodotorula sp.SH3)产酸性α -淀粉酶的工艺方法，包括培养基优化和发酵条件优化，其具体步骤如下:
(I)种子培养:种子培养基为胰蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L, KH2PO4 3 g/L, CaCl2 0.2 g/L，pH 调至 0，灭菌使用；菌种接入后于 37°C、200 r/min 培养12 h，即得种子液；基础发酵绘制产酶曲线(如图1)。
[0011](2)对发酵培养基的碳源进行优化，确定最佳碳源为可溶性淀粉，对其他成分如有机氮源、无机氮源、Ca2+浓度等完成优化。
[0012]优化的发酵培养基:蛋白胨30 g/L，可溶性淀粉15 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L,KH2PO4 3 g/L，CaCl2 0.2 g/L, pH 4.5。121°C灭菌 25 min ；
(3)发酵条件:对发酵培养条件如初始pH、温度、装液量、发酵时间进行优化，500 mL三角瓶装液200 mL发酵培养基，按照10%的接种比例接入种子液，初始pH4.5、发酵温度37°C、200 r/min摇床震荡培养，发酵14h，酶活为96.8 U/mg。
[0013]本发明解决的技术问题之三是获得酵母菌株SH3 (TfeoWorWa sp.SH3)发酵产品最适酶解淀粉的酶反应条件:
该酶耐受pH范围较广，为3.8-8.0，最适作用pH 5.0，具有很好的耐酸性(如附图2)；该酶最适作用温度50°C，于80°C下仍有酶活。
[0014]本发明的有益效果:自采集的面粉厂土壤中筛选获得一种产酸性α -淀粉酶的酵母菌株SH3 1.Rhodotorula sp.SH3)，获得了最佳的发酵产酶条件和方法，所产酸性α-淀粉酶使用PH范围广并具有很好的耐酸性和一定的耐高温性。
[0015]
【附图说明】
[0016]图1酵母菌株SH3在基础培养基中的产酶曲线。
[0017]图2不同反应pH下酵母菌株SH3的酸性α -淀粉酶活力。
【具体实施方式】
[0018]以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步的说明，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0019]实施例1:产酸性α -淀粉酶菌株的筛选
初筛:自面粉厂污水排出口附近采集土壤样品，十倍梯度稀释制备菌悬液，涂布初筛培养基平板，28°C恒温培养2-3d，测量水解圈直径/菌落直径的值，选取比值较大的点接传代于初筛培养基平板，培养24h后，淋撒碘液，测量透明圈/菌落直径比，将比值大的菌株接种于初筛培养基，冻存管_80°C保存。
[0020]复筛:将初筛酶活较高的菌株经初筛培养基活化后，转接于复筛培养基中，37°C、200 r/min培养12 h，测定发酵液酶活，获得酶活最高的菌株命名为SH3。
[0021]实施例2:酸性α -淀粉酶活性的测定
一个酸性α -淀粉酶酶活单位(IU)定义为:50°C、pH5.0条件下，10 min水解I mg淀粉所需的酶量。
[0022]酶活测定采用Yoo改良法:2.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液与2.5 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.0)50°C恒温水浴锅预热10 min，加入酶液0.5 mL，55°C下准确反应10 min,加入5 mL 0.1 mol/L的盐酸终止反应，取上述混合液0.5 mL与5 mL碘液混匀，660 nm测定吸光度值R(以2.5 mL蒸馏水代替可溶性淀粉溶液，其余条件相同作为空白)。在上述反应条件下，以0.5 mL的缓冲液代替0.5 mL酶液，测定吸光度值Rtl值。
[0023]酶活公式:待测酶活(U/mg) =100*D* (R0-R) /R，其中D:稀释倍数，Rtl:对照吸光值，R:酶液的吸光值，100:转换系数。
[0024]实施例3:酵母菌株SH3产酸性α -淀粉酶的发酵条件及方法
保藏菌种接入种子培养基，制得种子液10 mL接种到100 mL发酵培养基，从3h开始每小时测定酶活，以培养时间为横坐标，酶活力为纵坐标绘制产酶曲线。
[0025]培养基优化:以基础发酵培养基，设置0.5%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源，5%的接种量至100 mL发酵培养基中，37°C、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活，比较确定出最佳碳源为可溶性淀粉；同样通过以0.5%蛋白胨、棉籽饼、黄豆饼、牛肉膏作为氮源等，确定出最佳氮源为蛋白胨。
[0026]发酵条件的优化:设置初始发酵pH梯度4.5,5.0,5.5,6.0，设置500 mL三角瓶中装液量分别50、100、150、200 1^，设置发酵温度28、37、40°0振荡培养，以5%的接种量，产酶高峰期测定酶活，分别确定产酶发酵最佳初始PH4.5，最佳发酵温度37°C，500 mL摇瓶中最佳装液量200 mL。
[0027]对影响较大的四因素即碳源、氮源、初始pH和发酵温度，设计4因素3水平表，正交实验确定最佳发酵参数为:可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37°C、pH4.5。
[0028]从而获得酵母菌株SH3最佳发酵方法:发酵培养基:蛋白胨30 g/L，可溶性淀粉15 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L, KH2PO4 3 g/L, CaCl2 0.2 g/L, pH 4.5 ;发酵最佳条件:初始pH4.5、发酵温度37°C、500 mL三角瓶装液量200 mL、发酵14h ;对应条件下酸性α-淀粉酶发酵酶活力为96.8 U/mg ο
[0029]实施例四:酸性α-淀粉酶酶学性质
37°C,200 r/min培养48 h的发酵液上清作为粗酶，相同反应体系，pH 3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲条件，分别测定酶活以确定pH作用范围，结果如附图2所示，所产酸性α -淀粉酶耐受pH范围较广，为3.8-8.0，最适作用pH 5.0，具有很好的耐酸性。
[0030]37°C,200 r/min培养48 h的发酵液上清作为粗酶，相同反应体系，设置30~80°C温度条件测定酶活以确定温度耐受性，结果显示，所产酸性α -淀粉酶最适作用温度50°C，80°C下保留良好的酶活力。
【主权项】
1.一种产酸性α -淀粉酶的菌株，其特征在于:该菌株为红酵母(Rhodotorula sp.)SH3，该菌株于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0.10503。
2.根据权利要求1所述的产酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于:所述菌株为野生型菌株，该菌株的18S ITS序列已提交GenBank数据库，登录号为ΚΜ875707。
3.根据权利要求1所述的产酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于:所产α -淀粉酶耐受pH范围3.8-8.0，最适作用pH5.0，具有很好的耐酸性；最适作用温度50°C，于80°C下仍有酶活。
4.根据权利要求1所述的产酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于:所述菌株的筛选培养基为牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，琼脂粉15 g/L，使用前将pH调至5.0。
5.一种利用权利要求1所述菌株的发酵产酶方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)种子培养:种子培养基为胰蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10 g/L, (NH4)2SO4 2.5 g/L, KH2PO4 3 g/L, CaCl2 0.2 g/L，pH 调至 0，灭菌使用；菌种接入后于 37°C、200 r/min 培养12 h，即得种子液； (2)发酵培养基:优化后的产酶发酵培养基为蛋白胨30g/L，可溶性淀粉15 g/L,(NH4)2SO4 2.5 g/L，KH2PO4 3 g/L，CaCl2 0.2 g/L，pH 调至 4.5，121°C灭菌 25 min ； (3)发酵条件:500mL三角瓶装液200 mL发酵培养基，按照10%的接种比例接入种子液，于37°C、200 r/min摇床震荡培养，发酵1处，酶活为96.8 U/mg。
【专利摘要】本发明提供一种产酸性α-淀粉酶的菌株及其发酵产酶方法，属于生物工程技术领域。本发明菌种为一株自主分离自土壤的红酵母（Rhodotorula sp.）SH3，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10503，该菌株的18S ITS序列已提交GenBank数据库，登录号为KM875707。该菌产酶最优碳源可溶性淀粉15 g/L、最优氮源蛋白胨30g/L、最适温度37℃、最适pH4.5，该条件下酸性α-淀粉酶的酶活力为96.8 U/mg。所产的酸性α-淀粉酶最适作用pH5.0，耐受pH范围3.8-8.0，最适作用温度50℃，80℃下仍有酶活。CGMCC No. 1050320150202
【IPC分类】C12R1-645, C12N1-16, C12N9-30
【公开号】CN104651244
【申请号】CN201510126887
【发明人】屈建航, 李海峰, 翟丹丹, 胡元森, 王金水, 贾峰, 张帅兵, 蔡静平, 尹伊, 屈凌波, 刘仲敏
【申请人】河南工业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月23日